根据我们的经验，如为高拷贝质粒（如：pUC19等），使用100 ml培养液，可以纯化得到约200 μg高纯度质粒DNA。
对于低拷贝质粒，使用100～200 ml的菌体培养液进行质粒DNA的提取比较合适。如使用pBR322质粒时，从100 ml的菌体培养液中，可以纯化提取约50 μg的高纯度质粒DNA。若质粒量仍不够，可以多次提取后混合使用。
质粒DNA收量较低时，可以从以下几个方面考虑：
1. 大肠杆菌太陈旧（低温下长期保存的菌等）。请涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。
2. 质粒拷贝数低。使用低拷贝数载体时，每次产出的质粒DNA量会降低。
3. 确认操作过程的严密性。应严格按操作方法进行操作。
4. 洗脱时将Buffer PE加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。
5. 菌体量过多，裂解不充分，建议起始菌体量不得超过建议起始量。菌体量过多时，需要按照0.02 ml/OD600比例增加Buffer P1/P2/P3的加量，如菌体总量OD600=400时，Buffer P1/P2/P3的加量应为400 OD600*0.02 ml/OD600=8 ml。
6. 检查使用buffer pH是否改变， Buffer PW1（pH6.3）、Buffer PW2（pH7.0）、Buffer PE（pH9.5），若上述buffer pH发生变化，可以使用HCl或NaOH进行pH调节。
A-4：
裂解液Buffer P1、Buffer P2、Buffer P3可以使用如下溶液代替：
1. Solution Ⅰ：25 mM Tris-HCl（pH8.0）、10 mM EDTA（pH8.0），100 μg/ml RNase A;
2. Solution Ⅱ：0.2 M NaOH、1%（w/v）SDS；
3. Solution Ⅲ：5 M 乙酸钾 60 ml、冰乙酸 11.5 ml、H2O 28.5 ml，混合均匀后备用。
可参考《分子克隆实验指南》（第三版）附录1中碱裂解液Ⅰ、碱裂解液Ⅱ、碱性裂解液Ⅲ配制方法。
1. 菌体量过多，不能充分溶菌。使用本试剂盒时，每次可处理的菌体培养液为25～200 ml，超过此范围时，应按比例增加裂解液的用量。
2. 菌体沉淀悬浮不充分。在加入Buffer P1后，应使用振荡器（Vortex）等进行剧烈振荡使菌体沉淀充分悬浮后再做溶菌处理。
我们建议的溶解体积为200～1000 μl，请根据需要选择。
1. 加入Buffer P2后所有的振荡要轻柔，不可剧烈；
2. 加入Buffer P2后裂解时间不宜过长，不可超过5分钟；
3. 菌体培养时间不可过长，培养12～16小时为宜。
1. 确保Buffer P1中已经加入了RNase A；
2. 加入RNase A的Buffer P1应于4℃保存，若保存超过3个月，RNase A活性会下降，可以重新再添加RNase A（Code No. 2158）。
可考虑以下几种原因：
1. 加入Buffer P2后操作时间过长，不得超过5分钟。
2. 确保第二次加入Buffer PW1（即操作步骤10）前已将MidiEF DNA Column中的Filter移除。
3. 确保Buffer PW1、Buffer PW2添加顺序和添加量正确。
可考虑以下几种原因：
1. 质粒DNA贴附于离心管壁，呈透明状，不容易观察到，此时溶解DNA时应旋转离心管，使溶解buffer充分接触管壁。
2. 确保异丙醇的添加量符合要求，即0.7倍体积。
3. 处理时应小心操作，弃上清时不要将沉淀丢失。
4. 必要时提高离心转速，增加离心时间。
可考虑以下几种原因及改善方法：
1. 沉淀干燥过度。可以尝试将样品置于37℃条件下温浴2小时以改善溶解效果。
2. 沉淀中包含盐类或残留乙醇。使用70%乙醇再次清洗，或增加溶解buffer的量。
可考虑以下几种原因：
1. 菌体起始量过多，建议减少菌体起始量。
2. 确认Buffer PW1、Buffer PW2添加量及添加顺序是否正确。
3. 操作过程导致污染。确保操作中使用的离心管、移液管、玻璃器皿等器具满足无热原或无内毒素要求，确保使用的70%乙醇及溶解质粒DNA的buffer未被污染。
页面更新：2019-04-25 13:53:27
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