（1）模板DNA混入RNase或者EDTA等。
→模板DNA进行Proteinase K处理。
模板溶液中，加入终浓度为100 μg/ml的Proteinase K与终浓度为0.5％的SDS。37℃反应30分钟后，苯酚/氯仿处理、乙醇沉淀以及80%乙醇洗净处理。
（2）模板DNA中含有NaCl。
→高浓度（＞30 mM）的NaCl使RNA Polymerase活性下降。进行脱盐操作（使用Spin Column或者再次进行乙醇沉淀，80%乙醇洗净处理2次）除去NaCl。
（3）模板DNA量少。
→制备的模板DNA，不仅需要测定吸光度（OD260），还需要电泳确认，保证模板DNA用量准确。
（4）反应时间短。
→确认反应时间为1～2小时。根据模板DNA的不同，有必要适当延长反应时间。请尝试反应时间延长至4小时左右。
（1）使用了能形成3′突出的限制酶。
→以质粒DNA为模板时，线性化时如果形成3′突出末端，会合成很长的transcription RNA。不要使用形成3′突出的限制酶。
（2）质粒线性化时酶切不完全。
→线性化样品要电泳确认。如果酶切不完全，请再次进行酶切处理。
（3）电泳时RNA形成二级结构。
→in vitro transcription反应合成的RNA通常使用非变性凝胶电泳。如果形成二级结构，将出现比预想的条带大或者两条带。这时请使用变性凝胶电泳；或者合成的RNA与变性Buffer（64％甲酰胺、26 mM MOPS，pH7.2、6.45 mM 醋酸钠、0.6 mM EDTA）混合，65℃ 15分钟处理后电泳可以消除RNA二级结构的条带。
页面更新：2020-05-12 13:04:18
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