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当前位置:首页 > 技术资料 > 相关问答 > Takara > microRNA&RNAi研究相关制品 > In vitro Transcription T7 Kit (for siRNA Synthesis)
Q-1:RNA合成量少,怎么办?
A-1:

(1)模板DNA混入RNase或者EDTA等。
→模板DNA进行Proteinase K处理。
模板溶液中,加入终浓度为100 μg/ml的Proteinase K与终浓度为0.5%的SDS。37℃反应30分钟后,苯酚/氯仿处理、乙醇沉淀以及80%乙醇洗净处理。
(2)模板DNA中含有NaCl。
→高浓度(>30 mM)的NaCl使RNA Polymerase活性下降。进行脱盐操作(使用Spin Column或者再次进行乙醇沉淀,80%乙醇洗净处理2次)除去NaCl。
(3)模板DNA量少。
→制备的模板DNA,不仅需要测定吸光度(OD260),还需要电泳确认,保证模板DNA用量准确。
(4)反应时间短。
→确认反应时间为1~2小时。根据模板DNA的不同,有必要适当延长反应时间。请尝试反应时间延长至4小时左右。

Q-2:可见到多个反应产物,无目的产物的原因。
A-2:

(1)使用了能形成3′突出的限制酶。
→以质粒DNA为模板时,线性化时如果形成3′突出末端,会合成很长的transcription RNA。不要使用形成3′突出的限制酶。
(2)质粒线性化时酶切不完全。
→线性化样品要电泳确认。如果酶切不完全,请再次进行酶切处理。
(3)电泳时RNA形成二级结构。
in vitro transcription反应合成的RNA通常使用非变性凝胶电泳。如果形成二级结构,将出现比预想的条带大或者两条带。这时请使用变性凝胶电泳;或者合成的RNA与变性Buffer(64%甲酰胺、26 mM MOPS,pH7.2、6.45 mM 醋酸钠、0.6 mM EDTA)混合,65℃ 15分钟处理后电泳可以消除RNA二级结构的条带。