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当前位置:首页 > 技术资料 > 相关问答 > Takara > 核酸提取纯化及DNA标记 > TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit
Q-1:为什么提取组织或细胞时RNA Spin Column会出现堵塞现象?
A-1:

如果使用该试剂盒出现 RNA Spin Column堵塞现象,原因可能有以下几种:
1.样品裂解不充分。样品裂解不充分会导致RNA Spin Column的堵塞。关于组织或细胞的裂解请参见操作方法中的组织或细胞的裂解。难裂解的组织建议使用液氮研磨的方法进行裂解。
2.样品起始量过多。样品量过多会造成核酸量过多而发生堵塞现象。使用该试剂盒提取的组织或细胞的最佳起始量,请参考“不同组织的最佳起始量和裂解Buffer RL使用量”。
3.离心温度过低。使用该试剂盒进行RNA提取时,如无特殊说明均在室温(20~25℃)下进行。温度过高或过低都会对RNA Spin Column造成影响,发生堵塞现象。

Q-2:为什么提取组织或细胞时 gDNA Eraser Spin Column会出现堵塞现象?
A-2:

对于基因组含量较高或者样品起始量较大时,请不要使用gDNA Eraser Spin Coumn,以免gDNA Eraser Spin Column 发生堵塞。如果样品量较少或基因组含量较少也发生堵塞现象,则可能的原因是:
1.样品裂解不充分。样品裂解不充分会导致Column的堵塞。关于组织或细胞的裂解请参见操作方法中的组织或细胞的裂解。难裂解的组织建议使用液氮研磨的方法进行裂解。
2.样品起始量过多。样品量过多会造成核酸量过多而发生堵塞现象。使用该试剂盒提取的组织或细胞的最佳起始量,请参考“不同组织的最佳起始量和裂解Buffer RL使用量”。
3.离心温度过低。使用该试剂盒进行RNA提取时,如无特殊说明均在室温(20~25℃)下进行。离心转数过低。如发生堵塞的现象,可以加大离心转数以及离心时间。

Q-3:如果gDNA Eraser Spin Column 发生堵塞怎么办?
A-3:

如果 gDNA Eraser Spin Column 发生堵塞,则:
1.将样品吸出后直接进行后续实验。
2.增加离心次数和时间。
3.增大离心转数。
4.如果是基因组较多或起始量较大,不要进行gDNA Eraser Spin Column的过滤。

Q-4:为什么RNA收量过低?
A-4:

使用该试剂盒提取的组织或细胞的收量请参考“不同组织的RNA提取量”。如果RNA的收量过低,则可能有以下几种原因:
1.样品裂解不充分。样品的充分裂解是使用该试剂盒提取高质量RNA的关键。关于样品的裂解请参考操作方法中的组织或细胞的裂解。
2.样品起始量过多。使用该试剂盒提取的组织或细胞的最佳起始量,请参考“不同组织的最佳起始量和裂解Buffer RL使用量”。
3.RNA洗脱不充分。建议重复洗脱RNA一次。洗脱时可以将RNase Free dH2O或0.1% DEPC dH2O在RNA Spin Column 中的静置时间延长至10 分钟。
4.洗脱液中有乙醇残留。在使用Buffer RWB进行RNA Spin Column清洗后没有进行后续的离心过程,造成乙醇残留,使RNA的收量下降。建议在使用Buffer RWB清洗后再进行一次离心,以去除残留的乙醇。

Q-5:为什么RNA发生降解?
A-5:

如果提取时发生降解,则可能有以下几种原因:
1.使用的组织材料不够新鲜。应使用新鲜的组织材料,或将新鲜的组织材料用液氮迅速冷冻后置于-80℃保存。
2.提取RNA时使用的试剂及器具中混有RNA分解酶。实验前请参考“预防RNase污染的注意事项”,以避免RNase 污染。
3.提取的组织材料中含有大量RNA分解酶。RNA分解酶较多的组织或细胞应当减少样品起始量,并加大Buffer RL用量。

Q-6:提取的RNA中含有基因组DNA,怎么办?
A-6:

本试剂盒提供了去除基因组DNA的gDNA Eraser Spin Column,能够很好地去除材料中的基因组DNA,一般不会含有基因组DNA的污染。如果提取的RNA中含有基因组DNA污染,则可能有以下几种原因:
1.样品裂解不充分。样品不充分裂解会造成基因组DNA的残留。样品的裂解方法请参考操作方法中的组织或细胞的裂解。
2.样品起始量过多。过多的起始量使得核酸含量过多,超过gDNA Eraser Spin Column的承载量,造成基因组DNA残留。请参考“不同组织的最佳起始量和裂解Buffer RL使用量”。
3.样品的基因组DNA含量过高。不同组织中基因组DNA的含量不同,对于基因组DNA含量较高的样品,请减少样品起始量,并增加提取时Buffer RL的用量。
4.未进行DNase I的消化处理。对于部分基因组DNA含量较高的组织材料或后续实验对RNA纯度要求比较严格,则需进行DNase I的消化处理。请参考操作方法,进行DNase I的消化处理。

Q-7:RNA的吸光度代表的含义是什么?
A-7:

有关RNA的吸光度说明如下: 260 nm、320 nm、230 nm、280 nm下的吸光度分别代表了核酸、背景(溶液浑浊度)、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。OD260/OD280(R)体现了RNA中的蛋白质等有机物的污染程度,质量较好的RNA的R值应在1.8~2.0之间,当R<1.8时,溶液中蛋白质等有机物的污染比较明显;当 R>2.2时,说明RNA已经被水解成了单核苷酸。
在对核酸进行吸光度检测时,需要注意稀释液应使用TE Buffer。

Q-8:RNA的浓度怎样计算?
A-8:

RNA的浓度可以根据吸光度进行计算:
RNA浓度=(OD260-OD320)×稀释倍数×0.04 μg/μl 。

Q-9:使用本试剂盒提取小分子RNA,提取效果如何?
A-9:

使用本试剂盒能够有效提取分子量大于200 nt的RNA。对于分子量小于200 nt的RNA,使用本试剂盒不能很好地提取。

Q-10:使用本试剂盒提取基因组DNA,效果如何?
A-10:

本试剂盒只能进行简单的基因组DNA提取。基因组DNA的收量相对较低,可以进行简单的PCR扩增。当材料的基因组DNA不易提取、基因组DNA含量较低或者后续实验对基因组DNA要求较高时,请选用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0(Code No. 9765)进行提取,本试剂盒不承诺提取效果。

Q-11:裂解组织时,是否可以采用液氮研磨以外的裂解方式?
A-11:

裂解组织时,可以根据不同组织材料采取不同的裂解方式,如液氮研磨、组织匀浆器、组织破碎仪(NEXT ADVANCE BBX24B)、电动研磨器BioMasher(nippi)、一次性组织研磨杵等。一般的动物组织,如肝脏、胰脏、脑等易于破碎的材料,使用本试剂盒,经验证上述方法均适用,且RNA的收量及纯度差别不明显;但对于植物组织及肌肉等富含纤维的组织材料,仍建议客户使用液氮研磨等较为剧烈、充分的破碎方法,以保证组织材料的充分裂解;当组织材料量较少(不易获得)时,建议客户使用组织破碎仪(NEXT ADVANCE BBX24B)、电动研磨器BioMasher(nippi)或一次性组织研磨杵等在裂解过程中不易丢失组织材料的裂解方法。