Takara Bio公司销售有三种TB Green™ Green Assay用的广谱型Real Time PCR试剂，这些试剂的反应特异性以及扩增效率之间有以下关系。TB Green™ Premix Ex Taq ™ (Tli RNaseH Plus)（Code No. RR420A/B）是扩增效率与反应特异性综合性较好、通用性高的试剂，但是，如果想提高反应特异性，使用TB Green™ Premix DimerEraser™（Code No. RR091A/B）和TB Green™ Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR820A/B)则更有效。
应用二步法RT-PCR进行Real Time RT-PCR反应时，RT反应后，RT反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。例如：25 μl PCR反应体系中加入的RT反应液为1～2.5 μl。
不需要对Mg2+浓度进行研讨。如果使用本公司设计合成的引物或遵循各产品说明书中介绍的引物设计原则设计的引物，按照说明书推荐的反应条件进行反应，通常都会得到良好的实验结果。如果得不到良好实验结果，请研讨PCR反应条件或更换PCR引物等。
本公司「Perfect Real Time」系列产品的大量实验数据表明，两步法PCR可以缩短反应时间，增强反应特异性，提高扩增效率，可以得到良好的实验结果，所以我们推荐设定的标准程序为两步法PCR。退火/延伸温度为60℃，条件优化时可在60～66℃范围内研讨。避免退火/延伸温度设定为68℃，温度过高引物退火不完全，扩增效率下降。如果两步法PCR反应性能较差时，可变更为三步法PCR程序。可参考产品说明书对反应体系进行优化。
进行扩增效率良好的「Perfect Real Time」PCR反应，设计反应性能优越的引物非常重要。有时无论怎样进行条件研讨，都得不到良好的结果，此时建议重新设计引物。我们在各产品说明书中详细介绍了引物设计原则，请参考使用。同时，本公司还开设了Real Time PCR用引物设计合成服务，详细内容请参照“Real Time PCR用引物设计合成服务”部分。如果利用本公司设计合成的引物，按照说明书中推荐的标准两步法PCR程序，通常都会得到良好的实验结果，欢迎惠顾本公司 Real Time PCR用引物设计合成服务。
TB Green Premix Ex Taq（Tli RNaseH Plus）、TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）、TB Green DimerEraser和Premix Ex Taq不需要使用这一长时间的变性步骤，请遵照产品说明书的实验条件要求进行PCR反应。
有些公司的Premix制品中已经加有ROX Reference Dye，所以颜色较深。而TB Green® Premix Ex Taq™(Tli RNaseH Plus) 和TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) 在制品中没有添加ROX Reference Dye，但在制品包装中另外附有，所以TB Green® Premix Ex Taq™(Tli RNaseH Plus) 、TB Green® Premix Ex Taq™ II (Tli RNaseH Plus) 和TB Green® DimerEraser™颜色较淡。
融解不彻底时，有时会有白色絮状沉淀物。此时请用手稍微加热或于室温短时间放置制品，然后进行上下颠倒混合，使制品充分溶解。溶解后的制品性能不会受到影响，但请不要用振荡器等剧烈搅拌混合。
使用LightCycler2.0仪器，无法检测到Cy5标记的探针中Cy5信号，原因是：
LightCycler 2.0仪器的激发单元配备的是蓝色发光二级管LED光源，其最大发射光的波长为470 nm（纳米）。而Cy5的激发波长为649 nm，不能被蓝色二级管激发，所以检测不到任何信号。
Cy5标记的探针在ROCHE的LightCycler2.0荧光定量PCR仪上检测不到信号，是ROCHE仪器本身设置问题，与探针质量没有关系。
注意：使用LightCycler2.0荧光定量PCR仪时，探针的报告基团不要使用Cy5标记。
是的。FAM属于对pH敏感的染料，其荧光强度受pH影响较大（特别是在pH5-pH8范围内）。随着溶液pH值的升高，FAM染料的荧光强度增大（请参见下图）。
不建议使用未经纯化的脱盐引物进行荧光定量实验。在荧光定量实验中引物的纯度很重要，建议使用PAGE或更高纯化级别的引物。
页面更新：2018-10-22 10:41:21
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