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当前位置:首页 > 技术资料 > 相关问答 > Takara > cDNA合成 & 克隆 > 修饰酶-反转录酶、RNase抑制剂
Q-1:各种Reverse Transcriptase的区别?
A-1:

各种Reverse Transcriptase的区别如下:

Reverse Transcriptase PrimeScript

Reverse Transcriptase (M-MLV)

Reverse Transcriptase (AMV)



DNA Polymerase 5’→3’
Exonuclease
dsDNA 5’→3’
ssDNA 3’→5’
dsDNA 3’→5
RNase H

+

-
-
-
-

+

-
-
-
-

+

-
-
-
+


Single-Stranded DNA
Single-Stranded RNA

+
++

+
++

+
++

分子量
最适pH
金属离子
Processivity
Elongation速度
ddNTP的渗入
Vortex的影响

77,000
8.3
Mg2+
数百碱基
n.i.
n.i.
不太稳定

71,000
8.3
Mg2+
数百碱基
n.i.
n.i.
不太稳定

αβ157,000
8.3
Mg2+
数百碱基
4碱基/s

不太稳定

 
Q-2:合成不了长链cDNA的原因是什么?
A-2:

合成不了长链cDNA的原因如下:
1. RNase的原因(cDNA的电泳谱带出现模糊)。
对使用的器具、试剂请尽可能干热或者湿热灭菌处理。同时,在反应时请加入Recombinant RNase Inhibitor。
2. 反应条件不适合(cDNA的合成量少)。
请通过预备实验探讨适合的反应条件,此时所要研讨的项目包括:酶量、盐浓度、反应温度(37~65℃)、DTT浓度(0.5~10 mM)。
3. RNA结构上的问题(出现低分子带)。 尝试提高反应温度,请使用随机引物。

Q-3:使用Recombinant RNase Inhibitor要注意哪些问题?
A-3:

使用Recombinant RNase Inhibitor要注意以下问题:
1. 抑制活性的pH值范围较广,在pH7~8时表现最大活性。
2. 不要稀释使用。蛋白浓度过低易失活,而搅拌更易失活,因此建议尽量使用原液填加到反应体系中。
3. 起泡或强烈搅拌(Vortex等)会引起失活。
4. 不抑制RNase H活性。

Q-4:如何使用Recombinant RNase Inhibitor?
A-4:

使用例
cDNA第一条链的合成。
1. 在微量离心管中配制下列反应液,全量为20 μl。

模板RNA 1   μg
5 × Reverse Transcriptase XL Buffer* 4   μl
dNTP Mixture(10 mM each) 2   μl
Oligo(dT)18 Primer或Random Primer(6-9 mer) 50   pmol
Recombinant RNase Inhibitor 20   U
AMV Rtase 5   U
DEPC H2O Up to 20   μl
* AMV(Code No. 2621)制品中附有。

2. 轻轻搅拌。
3. 室温下10分钟放置后,移入42℃恒温槽中。
4. 42℃保温1小时。
5. 把样品移入冰中冷却2分钟。
(得到的反应液可用于cDNA第二条链的合成。)