各种DNA Polymerase的特性比较列表：
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Klenow Fragment的补平反应体系及反应条件如下：
| DNA | 500 | ng | |
| 10×buffer | 2.5 | μl | |
| dNTP | final 0.1 | mM | |
| Klenow | 0.5 | U | |
| dH2O | Up to 25 | μl |
37℃ 15 min
T4 DNA Polymerase具有比Klenow Fragment高出100～1,000倍的3’-Exonuclease活性。但Klenow不象T4 DNA Polymerase那样易受DNA二级结构的影响。因此，Klenow一般用于Dideoxy法测序、DNA的3’凹陷末端补平以及3’-末端标记；而T4 DNA Polymerase则用于DNA置换合成以及3’-末端平滑化。
另外，对于dNTP〔aS〕的活性也不同。Klenow虽然能使dNTP〔aS〕掺入，但不能利用Exonuclease活性切除。所以，想使DNA只从单方向缺失时，使用Klenow和dNTP〔aS〕修复一端后，其末端会对Klenow的Exonuclease活性以及BAL 31、Exo III等活性产生拮抗作用。而T4 DNA Polymerase即使掺入了dNTP〔aS〕也会切除掉。
Klenow补平3’末端后，一般多加一个碱基。突出末端通过3’-Exonuclease活性可以去除，但由于效率低，只能使50％左右的DNA末端平滑化。为了使DNA末端完全平滑化，建议使用T4 DNA Polymerase或者DNA Blunting Kit（Code No. 6025）。
与37℃时相比，约为1/2～1/3。由于在低温条件下3’-Exonuclease活性被抑制，因此，在低温下进行补平反应时应尽量延长反应时间（10℃，1hr or 0℃，3hr）。此时1 μg DNA使用酶量约3 U。
由于Klenow具有3′-Exonuclease活性（其单链特异性是相对的，对双链也作用），1 μg DNA使用1 U以上的酶时修复效果会下降。因此，相当于1 μg DNA请使用0.1 U左右的酶。另外，可以使反应在低温（10℃，1hr or 0℃，3hr）下进行。
Klenow对ddNTP的识别要比dNTP低103左右，必须极过量加入ddNTP才能完全修复。因此建议使用反转录酶。反转录酶对于ddNTP的识别不严格，也没有3′-Exonuclease活性，修复后不发生切入现象，可能会比Klenow更容易使用。
必须。但未必4种都需要。平滑时，只要向反应体系中加入0.1 mM左右平滑后的3’端最边上的碱基即可。T4 DNA Polymerase，1 U，37℃，5 min即可完成反应。
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| 不能，虽然5’突出的去磷酸化DNA可作底物，但不能作用3′-凹陷末端具有磷酸基的DNA。用Mung Bean Nuclease（Code No. 2420A）作用可形成平滑末端。 |
反应体系中须严格注意不要混入RNase。
实验器材（如：枪头、Microtube等）注意严格使用RNase Free用品。
实验操作时请注意戴一次性手套，防止RNase污染。
SP6 RNA Polymerase的使用注意事项：
1. 最适pH为7.5，需要Mg2+和还原剂的存在，添加BSA及亚精胺可提高酶的活性。
2. 最适反应温度为40℃（此时酶活性为37℃时的130%），当所用酶量不超过300 U/ml，模板量不超过0.1 mg/ml时与RNA的合成量呈正比例。如果反应时间超过1小时，反应温度以37℃为好。
3. 为了特定领域的有效转录，建议在其领域下游把模板DNA预先切成平端或5’突出末端。使用时，在反应缓冲液中必须添加DTT及BSA，否则有时不表现活性。
T7 RNA Polymerase的使用注意事项：
1. 最适pH为7.7～8.3。需要Mg2+和还原剂的存在，添加BSA及亚精胺可提高酶的活性。
2. 为了特定领域的有效转录，建议在其领域下游把模板DNA预先切成平端或5’突出末端。
3. 为了使T7 RNA Polymerase能够进行有效反应，在设计合成用于体外转录的模板用Oligo DNA时，T7 Promoter序列之前（5’端方向）应多加6个碱基。根据我们的经验，以加GATCAC为佳。
相关产品：in vitro Transcription T7 Kit（for siRNA Synthesis）（Code No. 6140）
反应结束后，最好进行Recombinant DNase I (RNase-free)（Code No. 2270A）进行处理，以分解残存在转录产品中的DNA模板。
使用例
在RNA上加上Poly(A)尾
1.在微量离心管中配制下列反应液。
| 10×Poly(A) Polymerase Buffer | 5 | μl | |
| MnCl2 | 5 | μl | |
| DTT | 5 | μl | |
| 0.1% BSA | 10 | μl | |
| ATP | 0.5 | μl | |
| RNA | 10 | μM | |
| Poly(A) Polymerase（2 U/μl） | 5 | U | |
| dH2O | Up to 50 | μl |
2. 37℃反应30分钟。
3. 加入50 μl（等量）的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），充分混匀。
4. 离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中。
5. 加入50 μl（等量）的氯仿/异戊醇（24：1），充分混匀。
6. 离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中。
7. 加入5 μl（1/10量）的3 M NaOAC（pH5.2）。
8. 加入125 μl（2.5倍量）的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
9. 离心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
10. 用于以后实验。
注）如需得到高纯度的Poly(A)RNA时，可以在操作2.后用Oligo(dT)-Cellulose层析进行纯化。
酶催化dNTP聚合于单链或双链DNA的3’-OH末端的反应，该反应不需要模板，但引物必须是至少有3个以上碱基的寡核苷酸。
TdT通过Okayama-Berg法被广泛运用于给载体、cDNA加上互补同聚尾的反应。反应受以下条件的影响：
1. 附加碱基的种类（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）
2. 反应缓冲液中二价阳离子的种类（Mg2+，Co2+，Mn2+）
3. DNA末端结构（3’-OH突出末端，平滑末端，3’-OH凹陷末端）。
反应时要根据情况选择最佳反应条件。一般，附加dATP和dTTP时，选择Co2+的Buffer；而附加的dCTP和dGTP时，选择含有Mn2+的Buffer为最适。附加15～40 base核苷酸的最佳反应条件为：
突出3’-OH末端：dNTP与DNA的摩尔比为20：1。
凹陷3’-OH末端：dNTP与DNA的摩尔比为100：1。
4. 有公司使用的反应缓冲液中含有二甲砷酸钠（剧毒）成份，使用起来很不方便且易发生危险。本公司推出的不含二甲砷酸钠的反应缓冲液，丝毫不影响酶的反应性能。
页面更新：2020-04-27 09:58:58
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