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Q-1:各种DNA Polymerase的特性比较?
A-1:

各种DNA Polymerase的特性比较列表:

Klenow Fragment

DNA Polymerase I(E.coli)

T4 DNA Polymerase


DNA Polymerase 5’→3’
Exonuclease
dsDNA 5’→3’
ssDNA 3’→5’
dsDNA 3’→5
RNase H

+

-
+
±
-

+

+
+
±
+

+

-
+++
+
-


Single-Stranded DNA
Single-Stranded RNA

+
±

+
±

+
-

分子量
最适pH
金属离子
Processivity
Elongation速度
ddNTP的渗入
Vortex的影响

68,000
7.4
Mg2+
10~50碱基
20~30碱基/s

不稳定

109,000
7.4
Mg2+
10~50碱基
20~30碱基/s

不稳定

114,000
8.8
Mg2+
n.i.
100碱基/s
n.i.
不稳定

 
Q-2:Klenow Fragment的补平反应体系及反应条件?
A-2:

Klenow Fragment的补平反应体系及反应条件如下:

DNA 500   ng
10×buffer 2.5   μl
dNTP final 0.1   mM
Klenow 0.5   U
dH2O Up to 25   μl

37℃  15 min

Q-3:Klenow和T4 DNA Polymerase有何差别?
A-3:

T4 DNA Polymerase具有比Klenow Fragment高出100~1,000倍的3’-Exonuclease活性。但Klenow不象T4 DNA Polymerase那样易受DNA二级结构的影响。因此,Klenow一般用于Dideoxy法测序、DNA的3’凹陷末端补平以及3’-末端标记;而T4 DNA Polymerase则用于DNA置换合成以及3’-末端平滑化。
另外,对于dNTP〔aS〕的活性也不同。Klenow虽然能使dNTP〔aS〕掺入,但不能利用Exonuclease活性切除。所以,想使DNA只从单方向缺失时,使用Klenow和dNTP〔aS〕修复一端后,其末端会对Klenow的Exonuclease活性以及BAL 31、Exo III等活性产生拮抗作用。而T4 DNA Polymerase即使掺入了dNTP〔aS〕也会切除掉。

Q-4:Klenow用于DNA末端的修复后,连接效率并不好,为什么?
A-4:

Klenow补平3’末端后,一般多加一个碱基。突出末端通过3’-Exonuclease活性可以去除,但由于效率低,只能使50%左右的DNA末端平滑化。为了使DNA末端完全平滑化,建议使用T4 DNA Polymerase或者DNA Blunting Kit(Code No. 6025)。

Q-5:想在16~22℃使用Klenow,此时的相对活性是什么?
A-5:

与37℃时相比,约为1/2~1/3。由于在低温条件下3’-Exonuclease活性被抑制,因此,在低温下进行补平反应时应尽量延长反应时间(10℃,1hr or 0℃,3hr)。此时1 μg DNA使用酶量约3 U。

Q-6:Klenow用于DNA修复时,DNA好像少量被分解了,为什么?
A-6:

由于Klenow具有3′-Exonuclease活性(其单链特异性是相对的,对双链也作用),1 μg DNA使用1 U以上的酶时修复效果会下降。因此,相当于1 μg DNA请使用0.1 U左右的酶。另外,可以使反应在低温(10℃,1hr or 0℃,3hr)下进行。

Q-7:为什么用Klenow和ddNTP进行末端标记的效率不理想?
A-7:

Klenow对ddNTP的识别要比dNTP低103左右,必须极过量加入ddNTP才能完全修复。因此建议使用反转录酶。反转录酶对于ddNTP的识别不严格,也没有3′-Exonuclease活性,修复后不发生切入现象,可能会比Klenow更容易使用。

Q-8:想用T4 DNA Polymerase将3’突出末端切成平末端时,dNTP必须吗?
A-8:

必须。但未必4种都需要。平滑时,只要向反应体系中加入0.1 mM左右平滑后的3’端最边上的碱基即可。T4 DNA Polymerase,1 U,37℃,5 min即可完成反应。

Q-9:超声波处理后产生的3’-凹陷末端具有磷酸基的DNA片段能用T4 DNA Polymerase修复吗?
A-9:
不能,虽然5’突出的去磷酸化DNA可作底物,但不能作用3′-凹陷末端具有磷酸基的DNA。用Mung Bean Nuclease(Code No. 2420A)作用可形成平滑末端。
Q-10:使用RNA Polymerase应注意哪些问题?
A-10:

反应体系中须严格注意不要混入RNase。
实验器材(如:枪头、Microtube等)注意严格使用RNase Free用品。
实验操作时请注意戴一次性手套,防止RNase污染。
SP6 RNA Polymerase的使用注意事项:
1. 最适pH为7.5,需要Mg2+和还原剂的存在,添加BSA及亚精胺可提高酶的活性。
2. 最适反应温度为40℃(此时酶活性为37℃时的130%),当所用酶量不超过300 U/ml,模板量不超过0.1 mg/ml时与RNA的合成量呈正比例。如果反应时间超过1小时,反应温度以37℃为好。
3. 为了特定领域的有效转录,建议在其领域下游把模板DNA预先切成平端或5’突出末端。使用时,在反应缓冲液中必须添加DTT及BSA,否则有时不表现活性。
T7 RNA Polymerase的使用注意事项:
1. 最适pH为7.7~8.3。需要Mg2+和还原剂的存在,添加BSA及亚精胺可提高酶的活性。
2. 为了特定领域的有效转录,建议在其领域下游把模板DNA预先切成平端或5’突出末端。
3. 为了使T7 RNA Polymerase能够进行有效反应,在设计合成用于体外转录的模板用Oligo DNA时,T7 Promoter序列之前(5’端方向)应多加6个碱基。根据我们的经验,以加GATCAC为佳。
相关产品:in vitro Transcription T7 Kit(for siRNA Synthesis)(Code No. 6140)

Q-11:使用RNA Polymerase时,反应结束后,是否需要做Recombinant DNase I (RNase-free)处理?
A-11:

反应结束后,最好进行Recombinant DNase I (RNase-free)(Code No. 2270A)进行处理,以分解残存在转录产品中的DNA模板。

Q-12:使用RNA Polymerase时,Poly(A) Polymerase的反应体系是什么?
A-12:

使用例
在RNA上加上Poly(A)尾
1.在微量离心管中配制下列反应液。

10×Poly(A) Polymerase Buffer 5   μl
MnCl2 5   μl
DTT 5   μl
0.1% BSA 10   μl
ATP 0.5   μl
RNA 10   μM
Poly(A) Polymerase(2 U/μl) 5   U
dH2O Up to 50   μl

2. 37℃反应30分钟。
3. 加入50 μl(等量)的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1),充分混匀。
4. 离心,取上层(水层)移至另一微量离心管中。
5. 加入50 μl(等量)的氯仿/异戊醇(24:1),充分混匀。
6. 离心,取上层(水层)移至另一微量离心管中。
7. 加入5 μl(1/10量)的3 M NaOAC(pH5.2)。
8. 加入125 μl(2.5倍量)的冷无水乙醇,-20℃放置30~60分钟。
9. 离心回收沉淀,用70%的冷乙醇清洗沉淀,真空干燥。
10. 用于以后实验。
注)如需得到高纯度的Poly(A)RNA时,可以在操作2.后用Oligo(dT)-Cellulose层析进行纯化。
 

Q-13:使用TdT酶要注意哪些问题?
A-13:

酶催化dNTP聚合于单链或双链DNA的3’-OH末端的反应,该反应不需要模板,但引物必须是至少有3个以上碱基的寡核苷酸。
TdT通过Okayama-Berg法被广泛运用于给载体、cDNA加上互补同聚尾的反应。反应受以下条件的影响:
1. 附加碱基的种类(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)
2. 反应缓冲液中二价阳离子的种类(Mg2+,Co2+,Mn2+
3. DNA末端结构(3’-OH突出末端,平滑末端,3’-OH凹陷末端)。
反应时要根据情况选择最佳反应条件。一般,附加dATP和dTTP时,选择Co2+的Buffer;而附加的dCTP和dGTP时,选择含有Mn2+的Buffer为最适。附加15~40 base核苷酸的最佳反应条件为:
突出3’-OH末端:dNTP与DNA的摩尔比为20:1。
凹陷3’-OH末端:dNTP与DNA的摩尔比为100:1。
4. 有公司使用的反应缓冲液中含有二甲砷酸钠(剧毒)成份,使用起来很不方便且易发生危险。本公司推出的不含二甲砷酸钠的反应缓冲液,丝毫不影响酶的反应性能。