BAP、CIAP特性比较请见下表：
为有效降低线性化质粒的自连背景，需在连接反应前将线性化载体去磷酸化，因此要用到碱性磷酸酶。BAP、CIAP和SAP三种碱性磷酸酶都可以去除载体或片段的5’-末端磷酸基团，但失活方法不同。
CIAP：在保存条件下极其稳定，但在螯合剂存在的条件下，经65℃、30分钟加热处理，99%的活性不可逆失活（根据反应条件不同有时也有例外）。建议失活处理时使用苯酚，可使酶完全失活。
BAP：是一种稳定性很高、每一个酶分子中含有2个Zn2+的金属蛋白质。在螯合剂存在的条件下，100℃加热可暂时性失活，但由于恢复至室温时酶活性可以恢复，因此必须进行苯酚处理，才能使其完全失活。
SAP：只要乙醇沉淀即可失活。
苯酚/氯仿抽提方法：
1. 加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），振荡2～3 min充分混匀。
2. 室温12,000 rpm离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中。
3. 加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），振荡2～3 min充分混匀。
4. 室温12,000 rpm离心，取上层（水层）移至另一微量离心管中。然后进行乙醇沉淀纯化。
乙醇沉淀的步骤：
1. 加入1/10体积的3 M CH3COONa（pH5.2），混匀。
2. 加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30～60分钟。
3. 12,000 rpm，4℃离心10 min，回收沉淀。
4. 用1 ml 70%的预冷乙醇清洗沉淀，12,000 rpm，4℃离心10 min，除去上清，真空或室温干燥沉淀，注意不要干燥过度。
5. 取适量TE Buffer或灭菌水溶解。
SAP降解PCR反应后残存dNTP的反应体系如下表：
| PCR Product | 6 | μl | |
| SAP（1 U/μl） | 0.2 | μl | |
| Exonuclease I（5 U/μl） | 0.2 | μl | |
| dH2O | up to 10 | μl |
37℃反应2小时
80℃反应15分钟
可做测序反应
通过下述的一种或两种操作能够提高去磷酸化处理的效率。
1. 提高反应温度进行反应（BAP：65℃，CIAP：约50℃）。
2. 把反应液中的Tris的浓度提高到1 M。
与最适条件相比效率会降低几分之一到十分之一左右，但由于酶一般为过量使用，如果DNA是5’突出末端则没有问题。但若5’凹陷末端，应尽量进行Buffer更换，在较高的温度下（50℃左右）反应。
不需要Zn2+。Mg2+浓度在0.5 mM时活性较0.1 mM时约提高3倍。
平滑末端及5’-凹陷末端的去磷酸反应，建议使用BAP（Code No. 2120）在高温（55℃～60℃）条件下反应。
推荐使用苯酚/氯仿/异戊醇抽提或凝胶回收纯化去磷酸的线性化DNA。
检测去磷酸化反应效果的方法：
1. 将去磷酸化处理的酶切线性载体，进行连接、转化、涂板。
2. 将酶切线性载体进行转化、涂板。
3. 将酶切线性载体进行连接、转化、涂板。
载体用量：大约0.03 pmol以上即可。
实验结果分析：如果去磷酸化效率较高，1.的菌落数与2.的菌落数接近；1.的菌落数远远低于3.的菌落数。
T4 Polynucleotide Kinase（T4 PNK）催化的核酸5’末端标记反应的效率受5’末端形状的影响较强。一般效率按：单链末端≥双链5’突出末端＞双链平滑末端＞双链3’突出末端的顺序降低。特别是由于双链的缺口（Gap）及切口（Nick）部分的磷酸化非常困难，所以，为了提高标记效率需要使用高浓度、过量的ATP。另外，即使同为平滑末端，富含AT的末端标记效率较高。
进行非标记的磷酸化反应时，请在反应液中加入终浓度1 mM的ATP。本制品中不另添附ATP。
本酶在70℃加热5分钟即可失活。
可以。但酶浓度要比使用〔γ-35P〕ATP时高2～3倍。
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