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各种连接酶特性比较请见下表：
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使用例
DNA片段和载体DNA的连接
1. 在微量离心管中制备下列连接反应液。
| 10×T4 DNA Ligase Buffer | 2.5 | μl | |
| DNA片段* | 约0.3 | pmol | |
| 载体DNA** | 约0.03 | pmol | |
| T4 DNA Ligase | 1 | μl | |
| 灭菌水 | up to 25 | μl |
* DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3～10倍。
** 平滑末端的载体与DNA片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其自身环化。
2. 16℃过夜反应。
3. 加入2.5 μl（1/10量）的3 M CH3COONa（pH5.2）。
4. 加入62.5 μl（2.5倍量）的冷无水乙醇，-20℃放置30～60分钟。
5. 离心回收沉淀，用70％的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。
6. 25～50 μl TE溶解，10～20 μl转化至100 μl的感受态细胞中。
与DNA分子大小有关，DNA浓度越稀越容易发生分子内连接反应。
从理论上讲，计算式：51.1/（DNA浓度：g/l）÷（分子量：dalton）0.5的值如果小于1就容易发生分子间的连接反应，大于2则易发生分子内的连接反应。
例如：
对于λDNA（48,502 bp），浓度大于1 μg/100 μl时，容易发生分子间连接；浓度小于1 μg/200 μl时，容易发生分子内连接。
对于质粒载体（约3,000 bp），浓度大于1 μg/25 μl时，容易发生分子间连接；浓度小于1 μg/50 μl时，容易发生分子内连接。
连接效率取决于末端碱基序列。
连接反应因末端碱基顺序的不同而反应速度各异，一般有下列倾向：
突出末端：Hind III＞Pst I＞EcoR I＞BamH I＞Sal I
平滑末端：Hae III＞Alu I＞Hinc II＞Sma I
EcoRV＞Sca I＞Pvu II＞Nru I
其中连接Hind III末端的速度约为连接Sal I末端速度的10～40倍；
而连接Hae III末端的速度约为连接Sma I末端速度的5～10倍。
与平滑末端相比，突出末端的连接效率大约高出100倍以上。
在100 μl感受态细胞中加入小于10 μl的连接液（含10% PEG）进行转化没有问题。有可能的话，建议通过乙醇沉淀进行Buffer交换。
想使DNA环化（Self ligation）时，请使用不含一价盐的缓冲液。PEG及高盐浓度可以促进分子间的连接反应；而对于分子内的连接反应，使用不含盐的Buffer可以得到更好的效果。
热击转化时，无需乙醇沉淀，可用连接液直接进行转化。
电转化时，需要对连接液进行乙醇沉淀纯化，去除盐离子再进行转化。
乙醇沉淀的步骤：
1. 加入1/10体积的3 M CH3COONa（pH5.2），混匀。
2. 加入2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30～60分钟。
3. 12,000 rpm，4℃离心10 min，回收沉淀
4. 用1 ml 70％的预冷乙醇清洗沉淀，12,000 rpm，4℃离心10 min，除去上清，真空或室温干燥沉淀，注意不要干燥过度。
5. 使用25～50 μl TE Buffer溶解，取10～20 μl转化至100 μl的感受态细胞中。
T4 DNA Ligase经过长达16小时的连接反应才能连接成功，而且反应常常受到DNA末端结构的影响。DNA Ligation Kit Ver.2.1中的Solution I含有T4 DNA Ligase，利用了T4 DNA Ligase及其相应的最佳缓冲体系，由于它的高效连接性能，可以将反应时间缩短至半个小时，并且不受DNA结构的影响。在使用DNA Ligation Kit进行环状DNA连接时，只需向DNA溶液中加入Solution I，即可在短时间内完成DNA连接。
该连接酶主要是应用于单链分子内连接的环化反应以及分子间的连接反应。最小底物为NpNpNOH（3’-OH Oligomer、受体）、pNp（5’、3’-DP monomer、供体）。连接效率受供体和受体各自的碱基影响很大。与RNA相比DNA连接的效率较低。
使用T4 RNA Ligase的注意事项有以下几点：
1. 分子间连接反应的最适反应温度为5～15℃，若超过该温度活性会被抑制。
2. 在PEG共存的条件下能够促进反应，而反应特异性不变。为了提高连接反应效率，建议使用酶浓度高而ATP浓度尽量低的反应条件。
3. 在10×反应缓冲液中如果直接加入0.1%的BSA会产生大量白色沉淀，因此在配制反应液时，请按下面顺序添加试剂：
dH2O→10×Buffer→0.1% BSA→底物RNA or DNA。
加入2 μl的0.5 M EDTA螯合Mg2+终止反应。
页面更新：2020-04-27 09:38:47
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