不需要。后一个特异性产物要比前一个短60～100 bp，当3rd PCR产物比2nd PCR产物稍短时，可以只回收3rd PCR产物。1st PCR产物基本上是AP引物的自扩产物或SP1引物的非特异性扩增结果，不需要回收测序。
Genome Walking Kit在进行PCR反应时的反应条件比较复杂，我们使用的是TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice（Code No. TP600）PCR扩增仪。使用其他PCR扩增仪（一个程序内不能设定9个温度梯度的PCR仪）时，可采用手动重复操作来完成实验。
具体可参考以下条件设定。
对于以下的循环条件：
| 94℃ | 30 sec； | 65℃ | 1 min； | 72℃ | 2 min |  |
|
| 94℃ | 30 sec； | 65℃ | 1 min； | 72℃ | 2 min | 15 Cycles | |
| 94℃ | 30 sec； | 44℃ | 1 min； | 72℃ | 2 min |
Genome Walking Kit的反应体系及反应条件经过对典型物种的研讨，可以适用于多种物种。一般情况下，四种AP引物中至少会有一种可以扩增出目的DNA片段。
原因及相应的解决方法如下：
1．如果后两次PCR扩增都没有得到清晰条带，可以尝试将上一步的PCR反应液进行适当倍数稀释，然后再进行PCR反应。
2．可能是起始基因组DNA模板中存在有抑制PCR反应的物质，此时可以尝试降低基因组DNA的用量或重新纯化基因组DNA。
3．特异性引物的设计对侧翼序列的获取起有至关重要的作用。当使用四条AP引物均无理想结果时，应考虑重新设计特异性引物。特异性引物设计时应严格遵守说明书中关于特异性引物设计的原则。
4．可以尝试适当增加3rd PCR反应的循环圈数。
可以首先使用一种AP引物进行实验。但为了提高实验成功率，我们建议使用四种AP引物同时进行实验，理论上至少会有一种以上的AP引物能够得到理想结果。
原因可能是非特异性扩增，或PCR产物不纯，也有可能是DNA本身结构复杂。可以重新设计测序引物，或考虑克隆测序。
我们曾尝试使用过25 μl反应体系，但结果并不如50 μl体系理想，所以我们推荐使用50 μl反应体系。
我们曾使用过其它Taq酶，但结果不如TaKaRa LA Taq理想。我们推荐使用TaKaRa LA Taq 。
页面更新：2020-04-26 13:23:21
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