大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都会在PCR产物的3′末端添加一个“A”，T载体是3′带有一个“T”的载体，在连接酶作用下，完成连接，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。TA克隆的原理请见下图：
蓝白斑筛选原理是：载体上携带一段细菌的lacZ基因，它编码β-半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的α-肽，载体转化的受体菌为lacZ△M15基因型。这样，载体同宿主通过互补，具有完整的β-半乳糖苷酶的活性。如果在载体的lacZ基因中插入外源DNA，造成lacZ基因缺失，不能合成α-肽，失去同宿主的互补，不能形成有功能的β-半乳糖苷酶，失去分解X-gal的能力。在X-gal平板上，含阳性重组体的细菌为白色菌落（质粒载体）或无色噬菌斑（M13噬菌体载体）；非重组体转化的细菌为蓝色菌落或蓝色噬菌斑。
常用的PCR产物克隆用T载体及各自的特点请见下表：
| Code No. | 产品 | 特点 | 应用 |
| 3275 | pBackZero-T Vector Cloning Kit | 由pUC19改建，阳性克隆率极高而背景极低。它消除了pUC19载体上的lacZ基因及多克隆位点，并对β-lactamase (bla) 基因进行了独特的改造，可以定向克隆。 | 使用时需在待插入的DNA片段的上、下游Primer的5′端加上TTTAA 5个碱基。如果需要进行定向克隆，只需在一条引物的5′端加上TTTAA 5个碱基。 PCR产物3′端有“A”，TA克隆。 |
| 6011 | pMD™18-T Vector Cloning Kit | 由pUC18构建，含有多克隆位点，可以进行蓝白筛选，无方向性克隆。 | PCR产物3′端有“A”，TA克隆。 |
| 6013 | pMD™19-T Vector Cloning Kit | 由pUC19构建，含有多克隆位点，可以进行蓝白筛选，无方向性克隆。 | PCR产物3′端有“A”，TA克隆。 |
| 3271 | T-Vector pMD™19 (Simple) | 由pUC19构建，不含有多克隆位点，可以进行蓝白筛选，无方向性克隆。 | PCR产物3′端有“A”，TA克隆。根据实验需要，可以在引物的5＇端导入酶切位点。 |
| 6012 | pSIMPLE-19 EcoR V /BAP Vector | 由pUC19构建，不含有多克隆位点，是种平末端去磷酸化载体，可以进行蓝白筛选，无方向性克隆。 | 与5′端磷酸化的平末端PCR产物进行连接。 |
| 3270 | T-Vector pMD™20 | 由pUC19构建，含有多克隆位点；并对lacZ基因进行改造，降低假阳性，可以进行蓝白筛选，无方向性克隆。 | PCR产物3′端有“A”，TA克隆；含有SP6 Promoter，可以对插入的DNA进行体外转录。 |
pMD19-T Vector与pMD18-T Vector相比，β-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。pMD18-T Vector连接转化后，一般要经37℃过夜培养，然后再将其于冰箱内放置一段时间后，其蓝白菌落才能显色。而pMD19-T Vector涂板培养后一般只需10个小时（37℃）便可以显色。因此，pMD19-T Vector比pMD18-T Vector更适合于蓝白菌落的筛选。
转化时请使用高效的感受态细胞（转化效率≥1×108 cfu/μg pUC19），这样才可能得到比较理想的阳性克隆。如果需要进行蓝白筛选时，宿主细胞必须具有正确的基因型（F′编码的［lacZ△M15］）产生ω Fragment，才可能和载体DNA产生的lacZ α多肽相结合，表现出β-半乳糖苷酶活性（α-互补性），才可以进行蓝白筛选。通常使用的JM109，DH5α等细胞均可进行蓝白筛选。
使用Takara克隆用T载体，对Insert DNA有以下的要求：
1．Insert DNA应该进行切胶回收的纯化处理后才进行载体连接，尽量避免引物等其它杂质的存在。切胶回收时可使用Takara凝胶回收试剂盒（Code No. 9762）。
2．Insert DNA的使用量及计算方法。
进行克隆时，Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比一般为1：3～10，可以根据具体的实验情况选择合适的Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比。
Insert DNA使用量的计算方法如下：
Insert DNA的使用量（ng）=nmol数×660×Insert DNA的bp数
Takara的T载体1 μl（50 ng）的摩尔数约为0.03 pmol。
取0.1 ng的pUC19 Plasmid DNA加入至100 μl的感受态细胞中进行转化，再加入900 μl的SOC培养基（0.1 ng DNA/ml），将上述培养液稀释10倍后（0.01 ng DNA/ml）取100 μl涂布平板（0.001 ng DNA/100 μl），记录菌落数。以得到200个克隆体为例计算转化效率，此时的转化效率=200 cfu/0.001 ng=2×105 cfu/ng=2×108 cfu/μg pUC19 DNA。
插入的DNA片段较短（小于500 bp），且插入片段没有影响lacZ基因的读框，此时平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色（或淡蓝色）。
应该从以下几点进行改善
1．确认Insert DNA片段的3′末端是否带有“A”尾。大部分的高保真DNA聚合酶（如：Pyrobest、PrimeSTAR HS、KOD、Pfx、Pfu等）扩增的PCR产物是平滑末端，不能直接进行TA克隆。
2．纯化PCR产物。最好使用切胶回收的PCR片段，以除去PCR产物中的非特异性片段和引物等杂质。进行切胶回收时可以使用Takara凝胶回收试剂盒（Code No. 9762）。
3．请使用转化效率大于108 cfu/μg pUC19 DNA的感受态细胞。
4．DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下，大片段DNA的克隆效率（连接效率与转化效率）偏低，此时可以延长连接反应时间，或采用电转化方法。
5．进行切胶回收纯化DNA片段时，不要使DNA片段在紫外线下暴露时间过长。
6．Solution I应尽量避免反复冻融。
7．建议使用新配制的平板培养基。
通常使用载体的通用引物进行测序。
1．pMD18-T Vector来源于pUC18载体，M13-47和RV-M等pUC18载体测序的通用引物都可以使用。
2．pMD19-T Vector、T-Vector pMD™19 (Simple)和pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector来源于pUC19载体，M13-47和RV-M等pUC19载体测序的通用引物都可以使用。
3．T-Vector pMD™20来源于pUC19载体，M13-47和RV-M等pUC19载体测序的通用引物都可以使用。
使用Takara克隆用T载体，应该注意以下几点：
1．Solution I请于冰中融解。
2．克隆时使用的Insert DNA片段（PCR产物）建议进行切胶回收纯化，否则PCR产物中的短片段DNA（甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段）、残存引物等杂质都会影响TA克隆效率。
3．按照本实验操作进行连接后，直接进行转化时的连接液不要超过20 μl。当要转化的DNA量较大或准备进行电转化时，需对连接液进行乙醇沉淀，纯化DNA后再进行转化。进行乙醇沉淀时使用Dr.GenTLE® Precipitation Carrier（Code No. 9094）可以提高DNA的回收率。
4．连接反应请在25℃以下进行，温度升高（>26℃）较难形成环状DNA。连接效率偏低时，可适当延长连接反应时间至数小时。
5．Takara克隆用T载体来源于pUC18或pUC19载体。因此，适合pUC18和pUC19载体的感受态细胞都可以使用，如：JM109等。
阳性克隆的鉴定方法有多种，主要的方法有以下几种：
1．蓝白斑筛选。
蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，一般情况下，β-半乳糖苷酶的表达将受到破坏，重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA片段插入载体时，基因的读码框有可能正好与lacZ的读码框相吻合，克隆体也会显示蓝色菌落。有报道称，2 kb的DNA片段插入到载体中后，重组克隆体仍显示了蓝色。所以，当我们没有得到白色菌落时，可以试着检测蓝色菌落。
2．菌落PCR方法。
以变性后的菌液为模板，使用载体通用引物进行PCR扩增鉴定。
使用灭菌后的牙签挑取白色菌落，在预备好的dH2O（10 μl）中蘸洗，99℃，10 min变性，冰上急冷，加入配制好的PCR混合液（引物，dNTP，Buffer，TaKaRa Taq等）。
| 94℃ | 1 min |  |
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| 94℃ | 30 sec | ||
| 55℃ | 30 sec | 30 Cycles | |
| 72℃ | 1 kb/min |
| 94℃ | 1 min | |
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| 94℃ | 30 sec | ||
| 55℃ | 30 sec | 30 Cycles | |
| 72℃ | 1 kb/min |
作为模板的菌落中，若混杂有微量的PCR产物，使用PCR扩增用引物就能检测到目的条带，而并非菌落自身扩增的PCR产物。为了避免出现假阳性现象，建议使用载体上的通用引物作为鉴定阳性克隆的扩增引物。
TA克隆没有方向性，但是可以通过以下方法进行方向的鉴定。
1．PCR方法。
使用载体上的一条通用引物和PCR扩增的一条引物，分别作为PCR扩增的上下游引物，对阳性克隆进行PCR扩增，通过是否有扩增产物来判断片段插入的方向。
2．酶切方法。
利用载体多克隆位点上的一个限制酶和PCR引物导入的酶切位点的一个限制酶，对阳性克隆质粒DNA进行双酶切鉴定。
可以从以下几点进行改进：
1. 为了提高加“A”反应效率，用于加“A”反应的末端平滑DNA片段应进行切胶回收的纯化处理，尽量避免引物等其它杂质的存在。切胶回收时可使用Takara凝胶回收试剂盒（Code No. 9762）。
2. 请使用转化效率大于108 cfu/μg pUC19 DNA的感受态细胞。
3. DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下，大片段DNA的克隆效率（连接效率与转化效率）偏低，此时可以延长连接反应时间，或采用电转化方法。
4. 进行切胶回收纯化DNA片段时，不要使DNA片段在紫外线下暴露时间过长。
5. Solution I应尽量避免反复冻融。
6. 建议使用新配制的平板培养基。
插入的DNA片段较短（小于500 bp），且插入片段没有影响lacZ基因的读框，此时平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色（或淡蓝色）。
页面更新：2020-04-26 13:10:16
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