大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都会在PCR产物的3′末端添加一个“A”,T载体是3′带有一个“T”的载体,在连接酶作用下,完成连接,其连接液可以直接用于细菌转化,大大方便了实验操作。TA克隆的原理请见下图:
蓝白斑筛选原理是:载体上携带一段细菌的lacZ基因,它编码β-半乳糖苷酶的一段146个氨基酸的α-肽,载体转化的受体菌为lacZ△M15基因型。这样,载体同宿主通过互补,具有完整的β-半乳糖苷酶的活性。如果在载体的lacZ基因中插入外源DNA,造成lacZ基因缺失,不能合成α-肽,失去同宿主的互补,不能形成有功能的β-半乳糖苷酶,失去分解X-gal的能力。在X-gal平板上,含阳性重组体的细菌为白色菌落(质粒载体)或无色噬菌斑(M13噬菌体载体);非重组体转化的细菌为蓝色菌落或蓝色噬菌斑。
常用的PCR产物克隆用T载体及各自的特点请见下表:
Code No. | 产品 | 特点 | 应用 |
3275 | pBackZero-T Vector Cloning Kit | 由pUC19改建,阳性克隆率极高而背景极低。它消除了pUC19载体上的lacZ基因及多克隆位点,并对β-lactamase (bla) 基因进行了独特的改造,可以定向克隆。 | 使用时需在待插入的DNA片段的上、下游Primer的5′端加上TTTAA 5个碱基。如果需要进行定向克隆,只需在一条引物的5′端加上TTTAA 5个碱基。 PCR产物3′端有“A”,TA克隆。 |
6011 | pMD™18-T Vector Cloning Kit | 由pUC18构建,含有多克隆位点,可以进行蓝白筛选,无方向性克隆。 | PCR产物3′端有“A”,TA克隆。 |
6013 | pMD™19-T Vector Cloning Kit | 由pUC19构建,含有多克隆位点,可以进行蓝白筛选,无方向性克隆。 | PCR产物3′端有“A”,TA克隆。 |
3271 | T-Vector pMD™19 (Simple) | 由pUC19构建,不含有多克隆位点,可以进行蓝白筛选,无方向性克隆。 | PCR产物3′端有“A”,TA克隆。根据实验需要,可以在引物的5'端导入酶切位点。 |
6012 | pSIMPLE-19 EcoR V /BAP Vector | 由pUC19构建,不含有多克隆位点,是种平末端去磷酸化载体,可以进行蓝白筛选,无方向性克隆。 | 与5′端磷酸化的平末端PCR产物进行连接。 |
3270 | T-Vector pMD™20 | 由pUC19构建,含有多克隆位点;并对lacZ基因进行改造,降低假阳性,可以进行蓝白筛选,无方向性克隆。 | PCR产物3′端有“A”,TA克隆;含有SP6 Promoter,可以对插入的DNA进行体外转录。 |
pMD19-T Vector与pMD18-T Vector相比,β-半乳糖苷酶的表达活性更高,菌落显示蓝色的时间缩短,菌落显示的蓝色更深。pMD18-T Vector连接转化后,一般要经37℃过夜培养,然后再将其于冰箱内放置一段时间后,其蓝白菌落才能显色。而pMD19-T Vector涂板培养后一般只需10个小时(37℃)便可以显色。因此,pMD19-T Vector比pMD18-T Vector更适合于蓝白菌落的筛选。
转化时请使用高效的感受态细胞(转化效率≥1×108 cfu/μg pUC19),这样才可能得到比较理想的阳性克隆。如果需要进行蓝白筛选时,宿主细胞必须具有正确的基因型(F′编码的[lacZ△M15])产生ω Fragment,才可能和载体DNA产生的lacZ α多肽相结合,表现出β-半乳糖苷酶活性(α-互补性),才可以进行蓝白筛选。通常使用的JM109,DH5α等细胞均可进行蓝白筛选。
使用Takara克隆用T载体,对Insert DNA有以下的要求:
1.Insert DNA应该进行切胶回收的纯化处理后才进行载体连接,尽量避免引物等其它杂质的存在。切胶回收时可使用Takara凝胶回收试剂盒(Code No. 9762)。
2.Insert DNA的使用量及计算方法。
进行克隆时,Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比一般为1:3~10,可以根据具体的实验情况选择合适的Vector DNA和Insert DNA的摩尔数比。
Insert DNA使用量的计算方法如下:
Insert DNA的使用量(ng)=nmol数×660×Insert DNA的bp数
Takara的T载体1 μl(50 ng)的摩尔数约为0.03 pmol。
取0.1 ng的pUC19 Plasmid DNA加入至100 μl的感受态细胞中进行转化,再加入900 μl的SOC培养基(0.1 ng DNA/ml),将上述培养液稀释10倍后(0.01 ng DNA/ml)取100 μl涂布平板(0.001 ng DNA/100 μl),记录菌落数。以得到200个克隆体为例计算转化效率,此时的转化效率=200 cfu/0.001 ng=2×105 cfu/ng=2×108 cfu/μg pUC19 DNA。
插入的DNA片段较短(小于500 bp),且插入片段没有影响lacZ基因的读框,此时平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色(或淡蓝色)。
应该从以下几点进行改善
1.确认Insert DNA片段的3′末端是否带有“A”尾。大部分的高保真DNA聚合酶(如:Pyrobest、PrimeSTAR HS、KOD、Pfx、Pfu等)扩增的PCR产物是平滑末端,不能直接进行TA克隆。
2.纯化PCR产物。最好使用切胶回收的PCR片段,以除去PCR产物中的非特异性片段和引物等杂质。进行切胶回收时可以使用Takara凝胶回收试剂盒(Code No. 9762)。
3.请使用转化效率大于108 cfu/μg pUC19 DNA的感受态细胞。
4.DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下,大片段DNA的克隆效率(连接效率与转化效率)偏低,此时可以延长连接反应时间,或采用电转化方法。
5.进行切胶回收纯化DNA片段时,不要使DNA片段在紫外线下暴露时间过长。
6.Solution I应尽量避免反复冻融。
7.建议使用新配制的平板培养基。
通常使用载体的通用引物进行测序。
1.pMD18-T Vector来源于pUC18载体,M13-47和RV-M等pUC18载体测序的通用引物都可以使用。
2.pMD19-T Vector、T-Vector pMD™19 (Simple)和pSIMPLE-19 EcoR V/BAP Vector来源于pUC19载体,M13-47和RV-M等pUC19载体测序的通用引物都可以使用。
3.T-Vector pMD™20来源于pUC19载体,M13-47和RV-M等pUC19载体测序的通用引物都可以使用。
使用Takara克隆用T载体,应该注意以下几点:
1.Solution I请于冰中融解。
2.克隆时使用的Insert DNA片段(PCR产物)建议进行切胶回收纯化,否则PCR产物中的短片段DNA(甚至是电泳也无法确认的非特异性小片段)、残存引物等杂质都会影响TA克隆效率。
3.按照本实验操作进行连接后,直接进行转化时的连接液不要超过20 μl。当要转化的DNA量较大或准备进行电转化时,需对连接液进行乙醇沉淀,纯化DNA后再进行转化。进行乙醇沉淀时使用Dr.GenTLE® Precipitation Carrier(Code No. 9094)可以提高DNA的回收率。
4.连接反应请在25℃以下进行,温度升高(>26℃)较难形成环状DNA。连接效率偏低时,可适当延长连接反应时间至数小时。
5.Takara克隆用T载体来源于pUC18或pUC19载体。因此,适合pUC18和pUC19载体的感受态细胞都可以使用,如:JM109等。
阳性克隆的鉴定方法有多种,主要的方法有以下几种:
1.蓝白斑筛选。
蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法,一般情况下,β-半乳糖苷酶的表达将受到破坏,重组克隆体在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养时将显示白色菌落。但有时比较短的DNA片段插入载体时,基因的读码框有可能正好与lacZ的读码框相吻合,克隆体也会显示蓝色菌落。有报道称,2 kb的DNA片段插入到载体中后,重组克隆体仍显示了蓝色。所以,当我们没有得到白色菌落时,可以试着检测蓝色菌落。
2.菌落PCR方法。
以变性后的菌液为模板,使用载体通用引物进行PCR扩增鉴定。
使用灭菌后的牙签挑取白色菌落,在预备好的dH2O(10 μl)中蘸洗,99℃,10 min变性,冰上急冷,加入配制好的PCR混合液(引物,dNTP,Buffer,TaKaRa Taq等)。
94℃ | 1 min | ![]() |
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94℃ | 30 sec | ||
55℃ | 30 sec | 30 Cycles | |
72℃ | 1 kb/min |
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作为模板的菌落中,若混杂有微量的PCR产物,使用PCR扩增用引物就能检测到目的条带,而并非菌落自身扩增的PCR产物。为了避免出现假阳性现象,建议使用载体上的通用引物作为鉴定阳性克隆的扩增引物。
TA克隆没有方向性,但是可以通过以下方法进行方向的鉴定。
1.PCR方法。
使用载体上的一条通用引物和PCR扩增的一条引物,分别作为PCR扩增的上下游引物,对阳性克隆进行PCR扩增,通过是否有扩增产物来判断片段插入的方向。
2.酶切方法。
利用载体多克隆位点上的一个限制酶和PCR引物导入的酶切位点的一个限制酶,对阳性克隆质粒DNA进行双酶切鉴定。
可以从以下几点进行改进:
1. 为了提高加“A”反应效率,用于加“A”反应的末端平滑DNA片段应进行切胶回收的纯化处理,尽量避免引物等其它杂质的存在。切胶回收时可使用Takara凝胶回收试剂盒(Code No. 9762)。
2. 请使用转化效率大于108 cfu/μg pUC19 DNA的感受态细胞。
3. DNA片段的立体结构、DNA片段的长短都会影响克隆效率。一般情况下,大片段DNA的克隆效率(连接效率与转化效率)偏低,此时可以延长连接反应时间,或采用电转化方法。
4. 进行切胶回收纯化DNA片段时,不要使DNA片段在紫外线下暴露时间过长。
5. Solution I应尽量避免反复冻融。
6. 建议使用新配制的平板培养基。
插入的DNA片段较短(小于500 bp),且插入片段没有影响lacZ基因的读框,此时平板培养基上出现的菌落有可能呈现蓝色(或淡蓝色)。