在设计酵母单杂交bait时需要考虑两点:顺式作用元件(cis-acting element)和启动子序列。
①使用cis-acting元件:
■ 使用最少数量的cis-acting元件,cis-acting元件超过20bp时会增加非特异性结合。Clontech
检测的最长的单拷贝cis-acting元件为20bp。
■ 如果你的cis-acting元件超过100bp,使用1个或2个拷贝。需要注意的是这么长的片段会提高假
阳性。
②使用启动子序列:
■ bait中不要包含TATA box。
■ 拷贝数:如果启动子序列小于100 bp,使用2个拷贝作为bait。如果超过100 bp,使用1个拷贝
作为bait。
■ 检测假阳性:构建好bait菌株后,检测报告基因的本底表达,以确认任何非特异报告基因激活
(参考操作手册)。
pAbAi空载的多克隆位点中Sma I和Xho I之间存在隐蔽的启动子,这个MCS可以被某些酵母体内蛋白
识别。如果这段识别序列是完整的,pAbAi载体会表现出自激活活性。因此,我们推荐退火后的核苷
酸(插入片段)的3’端带有Sal I了或Xho I酶切位点,而5’端可以是MCS中Sma I位点上游的任意的
单一酶切位点。同时,推荐采用mutant bait做为阴性对照。
页面更新:2015-01-14 11:19:11