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产品选择指南

技术服务信息

Q-1:什么是酵母双杂交技术?
A-1:

酵母双杂交(Y2H,yeast 2 hybrid)用于蛋白-蛋白相互作用研究。这项技术基于1989年Fields和Song[1]的研究,迄今已被引用超过28,000次。 在Matchmaker Gold Yeast Two Hybrid System中,目的基因与酵母GAL4转录因子的DNA结合结构域(DNA-BD)融合表达作为Bait蛋白。Prey 蛋白由目的基因与GAL4转录因子的AD融合表达, Bait融合蛋白自身不能激活转录但是可以与位于4个报告基因上游的GAL4应答启动子结合。互作蛋白,通常是文库形式,与酵母GAL4的转录激活域(AD)融合表达,作为Prey蛋白。当Prey蛋白与Bait蛋白有相互作用时,GAL4重构从而可以激活表达1个或多个报告基因。 ● [1]. Fields,S. and Song, O.(1989) Nature 340(6230):245-247

Q-2:为什么要使用酵母?
A-2:

酵母可以提供一个体内真核系统,同时又兼具原核细菌系统的可操作性强、简单易用的优点。基于以下几点,S. cerevisiae成为目前常用的酵母双杂技术的宿主菌:在酵母体内表达的蛋白质可以正确的折叠;提供中性pH内部环境;可以形成二硫键和其他真核系统共有的翻译后修饰。这些特点对于维持天然蛋白结构获得真实的蛋白互作关系至关重要。同时,酵母可操作性强,并且已进行全基因组测序。利用同源重组可以很方便地直接在酵母中构建文库。

Q-3:哪些因素会影响酵母双杂筛选结果?
A-3:

首先,要选择合适的bait蛋白,有些bait蛋白由于有自激活活性会产生很多假阳性。其次,要选择潜在互作蛋白代表性强的文库,如特异组织文库。同时,还要选择合适的筛选强度。如果筛选强度太高,将获得很少的阳性,如果筛选强度太低,会导致假阳性率过高。

Q-4:为什么酵母双杂要采用多个报告基因?
A-4:

酵母双杂交采用多个报告基因可以极大地降低假阳性,可以从以下几个问题回答:
①什么是假阴性和假阳性?
■假阴性是指目的蛋白在天然条件下可以与另一个蛋白互作,但是采用酵母双杂系统验证时为阴性。
■假阳性是指利用酵母杂交筛选获得的与bait有互作的prey蛋白,经过生理学方法验证与bait蛋白没有互作。
  假阳性是由于蛋白与GAL4 BD域、DNA或DNA相关蛋白互作引起。
②假阳性与背景生长有什么区别?
■ 酵母双杂系统只采用HIS3营养报告基因筛选蛋白-蛋白互作时,经常会获得大量的背景克隆和假阳性。
■ 背景克隆是由于营养报告基因泄露表达或涂板密度过高引起的。而假阳性是由于prey蛋白未与bait蛋白
  互作即可识别和结合报告基因上游序列引起的。
■ Matchmaker Gold系统采用新型的、稳定的酵母抗生素AbA,可以有效杀死非抗性克隆,从而极大地降低
  了背景克隆的生长。同时,Matchmaker Gold系统有效地减少了假阳性,这是由于任何prey蛋白单独结合
  引起假阳性都需要识别3个不同的启动子,激活4个报告基因的表达。Matchmaker Gold系统是唯一采用
  3个不同启动子控制4个报告基因表达的双杂交系统。

Q-5:用于酵母双杂筛选的bait蛋白有什么要求?
A-5:

· 通常来讲,bait不能带有跨膜结构域。
· bait和prey的互作不能依赖于糖基化,这是由于酵母翻译后修饰不包括糖基化。
· bait与GAL4 BD域融合表达后可以正确的折叠。
· bait不能激活酵母中报告基因的表达(即不能有自激活活性)。

Q-6:为什么需要验证bait的自激活活性?
A-6:

如果bait是真核转录因子,有可能在不需要与prey互作的情况下就可以激活酵母报告基因的表达,这就是自激活,可以通过检测bait菌株是否可以在含有AbA的选择性培养基上生长来进行验证(参考Matchmaker Gold操作手册)。如果你的bait可以激活报告基因,你依然可以进行酵母双杂交,不过首先需要去除转录激活域。例如,Matchmaker Gold系统中采用的阳性对照鼠类p53片段,去掉了N端可能含有转录激活域的71个氨基酸。

Q-7:为什么bait可以自激活酵母双杂系统?
A-7:

由于bait可能包含可以招募酵母内源转录因子的基序或结构域,也可能是bait可以直接与RNA聚合酶II形成转录起始复合物启动转录。疏水性或双亲螺旋可能会导致自激活[1-2]。酸性残基被认为与转录因子自激活区域相关[1,3-4];但是并不是所有的酸性蛋白都会激活转录。
● [1]. Ruden, D. M. (1992) Chromosoma 101(5?6):342-348.
● [2]. Abedi, M. et al. (2001) BMC Mol. Biol. 2:10.
● [3]. Ma, J. and Ptashne, M. (1987) Cell 51(1):113?119.
● [4]. Ruden, D. M. et al. (1991) Nature 350(6315):250?252.

Q-8:跨膜蛋白可以用作bait吗?
A-8:

可以,但是由于转录发生在细胞核内,所以互作的蛋白需定位到细胞核内才能发挥作用。即bait-prey的相互作用必须在细胞核内才能启动酵母基因组上报告基因的表达。只要蛋白能够正确折叠并定位到核内(Matchmaker 双杂交载体中都含有核定位信号),就可以检测bait蛋白与文库蛋白的互作。通常建议去掉bait蛋白的信号肽和跨膜结构域。
有很多用于膜蛋白酵母双杂研究的文献可供参考:
● Hopkinson, S.B. & Jones, J.C. (2000) Mol. Biol. Cell. 11(1):277–286.
● Traweger, A. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277(12):10201–10208.
● Tian, X.Y. et al. (2001) Reproduction. 121(6):873–880.
● Daniel, J.M. & Reynolds, A.B. (1999) Mol. Cell. Biol. 19(5):3614–3623.
● Rochdi, M.D. et al. (2004) J. Biol. Chem. 279(18):18981–18989.

Q-9:Matchmaker GAL4 DNA-BD和AD载体的核定位序列位于什么位置?
A-9:

DNA-BD载体(pGBKT7 vector)的核定位序列是天然GAL4蛋白固有的一部分,位于结合结构域的氨基末端。精确的位点及有关描述可以参考Fields & Song (1989)。天然GAL4 AD中不带有核定位序列,所以在GAL4 AD 载体的激活区域添加了SV40 T-抗原核定位序列。

Q-10:可以用于酵母双杂交实验的最小和最大bait为多大?酵母双杂交分析可以筛选到的最小蛋白和最大蛋白为多大?
A-10:

我们不确定可以用于酵母双杂筛选最小的bait蛋白为多大。以经验来看,bait也不宜过大,过大的外源性融合蛋白在酵母中不稳定,我们推荐bait不超过100kD,或bait载体的DNA插入片段不超过3kb。大多数情况下,bait的设计依赖于经验,很难确定bait的效果会如何。酵母杂交中插入片段的N端与147个氨基酸的GAL4 BD融合表达,这可能会影响蛋白折叠,以及插入的结构域能否进行蛋白互作。比较大的bait可能会引起非特异性互作而提高背景,推荐使用较小的、特异的bait进行酵母双杂交实验。小至8个氨基酸,大至750个氨基酸的蛋白都已经被成功用于酵母双杂交研究。
● Heery, D.M. et al. (1997) Nature 387(6634):733–736.
● Schaefer B.C., Ed. (1997) Gene Cloning and Analysis: CurrentInnovations,
   (Horizon Scientific Press), pp 11–28.