经过验证，同源序列少于12个碱基或者多于20个碱基克隆效率都会明显降低。因此推荐附加15 bp
同源碱基序列。
15 bp同源序列必须与线性化载体最末端的15 bp完全相同（更多信息请参考操作手册）。如果
15 bp同源序列错开几个碱基，In-Fusion反应可能也可以起作用，但是在Clontech没有进行验证。
是的。例如，在15 bp同源序列和目的基因序列之间引入Kozak序列(CCACC)，实验结果不会受到
任何影响。同样也可以包含限制性酶切位点或者融合标签。PCR引物按顺序应该包含以下序列
(listed 5' to 3'): 15 bp同源序列，Kozak序列或者限制性酶切位点，目的基因序列。
阅读框是由引物序列来决定的。例如，创建一个融合蛋白质时，如果引物中15 bp同源序列对应于
第一个目的基因的最后5个密码子，那么您需要将第二个目的基因起始密码子放置在同源序列的最
后一个密码子之后（也即是同源序列的3'端），以保证第二个目的基因与第一个目的基因在同一个
读码框内。如果读码框发生滑动的话，您可以在15 bp 同源序列之后和目的基因第一个密码子之前
简单添加1-2个额外碱基就可以。
在载体内部而不是在临近载体线性化的位点发生重组事件的概率极低。为了验证这一点，我们采用
Sal I和Hind III双酶切pDNR-Dual载体。这样，In-Fusion PCR引物的15 bp同源序列始终包含编码
loxP位点的序列。尽管pDNR-Dual在氯霉素抗性基因的两侧有两个loxP位点，只有不到1%的克隆
发生了错误。因此，即使同源序列在载体序列上出现多次，错误重组事件发生的可能性也非常小。
答案是否定的，In-Fusion克隆反应并不依赖于5'磷酸基团，因此采用常规的引物扩增得到的两个
PCR产物即可进行有效的In-Fusion克隆反应。
脱盐处理获得的引物即可满足In-Fusion有效克隆的高质量要求。无需进行胶纯化或者HPLC纯化。
是的，任何载体均适用。经过验证In-Fusion酶可以有效作用于多种载体类型。我们将 2.5 kb的
PCR片段成功克隆到了33 kb的腺病毒载体中。值得注意的是，大载体(>10 kb)的克隆效率会有
所下降。
是的，所需载体必须是线性化的。进行In-Fusion克隆反应的线性化载体可以通过酶切处理（单酶
切或者双酶切）的方式获得，也可以通过反向PCR扩增获得。In-Fusion反应不依赖于5’磷酸基
团，因此只要拥有15 bp同源序列，即使是没有经过修饰的两个PCR产物也可以连接在一起。
我们建议采用双酶切而不是单酶切方法处理载体，以最大限度减少载体自连产生的背景。在限制
性内切酶不产生星活性的前提条件下，建议酶切时间为3-24小时。反向PCR扩增载体片段，然后
采用Cloning Enhancer进行纯化处理，这也是一个非常有效的载体线性化的方法。
页面更新：2015-01-06 10:01:36
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