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当前位置:首页 > 技术资料 > 相关问答 > Takara > 限制酶 > 限制酶相关问答
Q-1:《限制酶在各种通用缓冲液中的相对活性》中,记载了限制酶在各种通用缓冲液中的相对活性,但有时其它的缓冲液比产品附带的缓冲液具有更高活性(例如Hind III附带的缓冲液是M,但缓冲液K显示出200%的活性)。在这种情况下,选用相对活性高的缓冲液进行反应,有没有问题?
A-1:

没有问题。附带的缓冲液是进行活性测定的缓冲液,选择了与原来的基本缓冲液组份相近的缓冲液,未必是活性最高的缓冲液。使用附带的缓冲液以外的缓冲液进行反应,也是没有问题的,但数字上加()的缓冲液,是易受Star活性等影响的缓冲液,应避免使用。

Q-2:为什么有些限制酶的附带Buffer,使用的是比Basal Buffer相对活性要低的Universal Buffer?
A-2:

为了方便实验操作,Takara采用了通用缓冲液(Universal Buffer)的限制酶活性表示方法,同时也满足双酶切反应(Double Digestion)的要求。本公司的限制酶尽可能地配备Universal Buffer。例如:L、M、H Buffer等。对一些常用的限制酶,还对同步双酶切反应条件作了严格的研讨,其结果见Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表,请参考使用。而对一些在5种Universal Buffer中相对活性都不太高的限制酶,附带其Basal Buffer。但请注意,因为Basal Buffer为各种限制酶的最适Buffer,其组成也根据酶种类的不同而不一样。

Q-3:底物DNA没有被所用限制酶切断,为什么?
A-3:

可以考虑以下几种情况:
■ 1. 底物DNA上没有该限制酶的识别、切断位点。特别是一些经过重组等处理的DNA,碱基易发生缺失、变化等。
■ 2. 限制酶识别位点上的A或C被甲基化。部分限制酶对识别位点中的碱基是否被甲基化比较敏感,从而无法切断该位点。有关甲基化对限制酶的酶切反应的影响,请参考甲基化对限制酶活性影响的表格,其中做了详细说明。
■ 3. 底物不纯。如果底物DNA中含有限制酶阻害物质,会影响限制酶的酶切作用。在此种情况下,底物DNA须重新进行纯化。
■ 4. 限制酶的识别、切断位点在底物DNA的高级构造中所处的位置,对酶切反应也有一定的影响。
■ 5. PCR引物的酶切位点前没有保护碱基或引物合成有误,致使没有正确的酶切位点存在。PCR产物酶切前尽量进行精制以更换Buffer,避免PCR产物中带入的其它物质影响酶切反应。据报道,通常PCR产物的添加量占总反应体积25%以下没有问题。
■ 6. 不同公司的酶和Buffer不要交叉使用,否则可能会影响酶切效果。

Q-4:Takara限制酶可以稀释使用吗?
A-4:

不稀释为好,Takara的限制酶都根据最佳反应体系配制了浓度。酶制品稀释时,酶浓度和活性之间不呈直线对应关系,酶浓度越稀,相对活性越低,并且越不稳定,有时便会出现底物DNA不能切断之现象。

Q-5:怎样确认酶切位点是否被甲基化?
A-5:

一般情况下,从大多数的大肠杆菌中提取的DNA,几乎都存在被甲基化的现象,其相对应识别序列的受甲基化影响的限制酶即切不开该酶切位点。而只有在转化时选用了甲基化酶欠损的大肠杆菌作为宿主,提取的DNA才不会被甲基化。在实际操作中,如果使用受甲基化酶影响的限制酶对从一般的大肠杆菌中提取的DNA进行酶切反应,而没切开,或者对测序结果有酶切位点的片段,切不开,其酶切位点被甲基化的可能性就比较大,这时就要选用不受甲基化影响的限制酶进行酶切。

Q-6:酶切位点被dam或dcm甲基化,要想切开怎么办?
A-6:

一种方法是,选用不受dam、dcm甲基化影响的限制酶进行酶切反应。例如Sau3A I、Mbo I具有相同的酶切位点,但Mbo I受dam methylase的影响,而Sau3A I不受dam methylase的影响。另外一种方法是,使用dam、dcm甲基化酶欠损的宿主菌(例如GM33、JM110)进行DNA的转化和制备。还可以使用PCR方法对该DNA进行扩增,然后再进行酶切。

Q-7:限制酶活性定义的1 U是在37℃条件下,经1小时,将1 μg λ DNA完全切断的酶量,对所有的底物DNA都可以完全切开吗?
A-7:

由于底物DNA的不同,其含有的酶切位点的摩尔浓度不同,空间结构也不相同,这些,都会对酶切反应的速度产生影响,所以,相同的酶量,不一定能将不同的底物切开。

Q-8:设计引物做PCR扩增时,酶切位点的保护碱基如何设计比较合适?
A-8:

各种限制酶,所需要的酶切位点的保护碱基的数量不同。一般情况下,在酶切位点以外多出3个碱基,即可以满足几乎所有限制酶的酶切要求。

Q-9:在限制酶的有关甲基化的影响项目中提到的CG methylase、dam methylase、dcm methylase的影响是怎么一回事?
A-9:

通常情况下,来自于哺乳类生物的基因组DNA中的CG序列,被CG methylase甲基化,形成5mCG。另外,由于生物学实验操作中被普遍使用的大肠杆菌(JM109、HB101等)几乎都含有dam methylase和dcm methylase,从这些宿主中提取的质粒DNA的GATC、CCWGG序列被甲基化,分别形成G6mATC、C5mCWGG。受甲基化影响的限制酶切不断其识别序列中被甲基化的DNA。所以,用于反应的DNA,会因为来源不同而出现切不开的现象。因此,在反应之前,一定要对DNA被甲基化的情况和所使用的限制酶受甲基化影响情况进行确认。

Q-10:限制酶名称一栏中写有Sau3A I(Mbo I),这两种限制酶可以一样使用吗?
A-10:

限制酶名称()里记载的是该限制酶的同裂酶(Isoschizomer)。具有相同的识别序列的限制酶互称为同裂酶。Sau3A I和Mbo I是具有相同识别序列和切断位置的同裂酶,Mbo I由于受dam methylase的影响,不能够切断来自于一般大肠杆菌的DNA。而Sau3A I不受dam methylase的影响,可以切断一般大肠杆菌由来的DNA。有些同裂酶切断位置不一样,即虽然识别序列一样,但切断位置不同,使用时必须注意。另外,即使是切断位置相同的同裂酶,其受甲基化的影响情况有时也不一样。

Q-11:如何确定两种酶的同步双酶切反应缓冲液?
A-11:

请参看《Double Digestion(双酶切反应)时的Universal Buffer(通用缓冲液)的使用 表》,选择双酶切反应时的通用缓冲液。Takara公司从1979年开始生产限制酶以来,做了大量的基础实验,也积累了很多经验,同步双酶切通用缓冲液表格中所推荐的双酶切Buffer完全是依据具体实验结果得到的。Takara公司为了方便限制酶的统一使用,采用了通用缓冲液(Universal Buffer)系统,并列出了各种限制酶在各种通用缓冲液中的相对活性。如果两种酶在《Double Digestion(双酶切反应)时的Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表》中没有找到同步双酶切的通用缓冲液,我们可以在《用Universal Buffer和Basal Buffer进行限制酶活性表示》表中挑选一种通用缓冲液进行双酶切反应,其条件是:两种酶在这种通用缓冲液中的相对活性都比较高(60%以上)。如果没有找到同步双酶切的通用缓冲液,通常要进行分步酶切,即先做一种酶切,乙醇沉淀纯化后,再做另一种酶切反应。

Q-12:底物DNA经酶切后,电泳无条带或出现Smear现象,如何解决?
A-12:

底物DNA或酶切试剂中混有DNase,在一定的温度或缓冲液的作用下,激发DNase发挥作用,将底物DNA降解。可以使用其他限制酶酶切底物DNA,也可以使用此酶切其他底物DNA,来验证酶和底物DNA是否有问题。如果质粒酶切出现此情况,首先将质粒做乙醇沉淀再酶切。

Q-13:乙醇沉淀的方法?
A-13:

乙醇沉淀的方法如下:
■ 1. 加入1/10体积的3 M CH3COONa(pH5.2),混匀。
■ 2. 加入2.5倍体积的预冷无水乙醇,混匀,-20℃放置30~60分钟。
■ 3. 12,000 rpm,4℃离心10 min,回收沉淀。
■ 4. 用1 ml 70%的预冷乙醇清洗沉淀,12,000 rpm,4℃离心10 min,除去上清,真空或室温干燥沉淀,注意不要干燥过度。
■ 5. 沉淀用灭菌蒸馏水或TE溶解,进行后续反应。

Q-14:简并碱基的种类有哪些?
A-14:

简并碱基的种类表示如下:
M:A or C            R:A or C           S:C or G
K:G or T            Y:C or T????????????H:A or C or T
N:A or C or G or T?      W:A or T      D:A or G or T

Q-15:酶切产物是否可以用苯酚/氯仿抽提、切胶回收和片段回收试剂盒纯化?
A-15:

以上的纯化方式都可以对酶切产物进行纯化。但是一般苯酚/氯仿抽提和切胶回收的损失比较大。分步酶切的中间产物可以使用乙醇沉淀和片段回收试剂盒(在允许纯化的片段长度范围内使用)进行纯化,这样操作可以减少损失。

Q-16:引起Star活性的因素及抑制的方法?
A-16:

① 引起Star活性的原因:
■ 1. 较高的甘油浓度(>5% v/v)。
■ 2. 酶与底物DNA比例过高(不同的酶情况不同,通常为>100 U/μg)。
■ 3. 低盐浓度(<25 mM)。
■ 4. 高pH值(pH>8.0)。
■ 5. 存在有机溶剂(如DMSO、乙醇、乙烯乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等)。
■ 6. 用其他二价离子替代镁离子(如Mn2+,Cu2+,Co2+,Zn2+等)。 Star活性是内切酶的一种普遍现象,但是大多数可以控制,正常情况下使用宝生物提供的缓冲液就不会出现Star活性。
② 抑制Star活性的方法:
■ 1. 尽量使用较少的酶进行完全消化反应。这样可以避免过度消化以及过高的甘油浓度。
■ 2. 尽量避免有机溶剂(如制备DNA时引入的乙醇)的污染。
■ 3. 将离子浓度提高到100~150 mM(若酶活性不受离子强度影响)。
■ 4. 将反应缓冲液的pH值降到7.0。
■ 5. 二价离子使用Mg2+

Q-17:EcoR I等普通限制酶有高浓度制品,一般如何使用?
A-17:

通常使用高浓度限制酶酶切gDNA等高浓度DNA样品,这样可以避免在反应液中加入过量的甘油,从而有效防止Star活性产生。此外,对于需要大量酶的脉冲场电泳,使用高浓度限制酶更方便。但需要注意,当反应液中底物DNA浓度较低时,加入适当活性单位的高浓度限制酶,操作会很困难,这种情况下推荐使用普通浓度的限制酶制品。 两种浓度限制酶在保存稳定性上是一致的。

Q-18:限制酶、DNA底物的使用量、浓度及酶切时间为多少比较好?
A-18:

每种限制酶、DNA底物的标准使用量,请参考说明书中“一般反应体系”内容。
限制酶的活性单位是按照反应1小时定义的,通常建议反应时间从1小时至几小时。反应中使用的标准酶量是反应体系的1/20体积量。如果要增加酶的使用量,请控制在反应体系的1/10体积量以下。限制酶溶液中的甘油如果过量(5%以上)引入到反应液中,会影响限制酶识别DNA序列,从而导致不正确的序列识别,产生非特异性酶切。如果使用的酶量(U)相对于DNA底物不足,则需要更长的酶切反应时间。另外,限制酶的活性受到识别位点前后序列的影响,酶切难易程度不同。

Q-19:酶切反应后,限制酶必须做失活处理吗?
A-19:

限制酶反应后立即进行电泳时,只需添加10×Loading Buffer,不需要进行限制酶的失活处理。但是,限制酶中有稳定性高的酶,如果直接进行后续反应残留的酶活性可能会对反应产生影响。很多限制酶可以通过加热失活,但是有的酶经70°C加热处理也不能完全失活。对于这样的酶,请使用苯酚进行完全失活处理。关于失活处理后残存活性的数据,请参考以下网站内容。
各种失活处理后限制酶的残存活性

Q-20:DNA底物溶解在TE缓冲液中,缓冲液中的EDTA会不会影响限制酶反应?
A-20:

酶切反应中,Mg离子是必需的。过量的EDTA会螯合反应液中的金属离子,阻碍酶切反应。核酸制备一般含有1 mM的EDTA。反应液中加入1/10左右体积量的DNA底物时,对反应没有影响。

Q-21:哪种限制酶可用于去除PCR产物中的质粒模板?
A-21:

可以使用能够切断腺嘌呤甲基化GmA↓TC的Dpn I (Code No. 1235A/B)。该酶能切断甲基化的GmATC,但不能切断未被甲基化的GATC。该酶能够切断来源于常用大肠杆菌(dam+)的DNA,不能切断PCR产物,因此可用于去除PCR产物中的质粒模板。

Q-22:是否可以使用QuickCut限制酶的Buffer将QuickCut限制酶与我们的普通限制酶一起进行双酶切?
A-22:

QuickCut限制酶不建议与普通限制酶同时使用,进行同步双酶切。如果需要进行双酶切,可以考虑分步酶切,一种酶切结束后经过乙醇沉淀再使用另一种酶进行酶切。

Q-23:普通限制酶是否可以搭配QuickCut Buffer使用?
A-23:

普通限制酶不建议搭配QuickCut Buffer使用。

Q-24:进行双酶切时QuickCut限制酶的使用量是多少? 如果两种酶的反应温度不同,如何操作?
A-24:

使用QuickCut限制酶进行双酶切时,两种酶的总加量不超过反应体系的1/10。
如果各酶的反应温度不同,建议按低温到高温的顺序加入相应的QuickCut限制酶进行分步酶切反应。

Q-25:使用QuickCut限制酶是否可以进行长时间酶切反应?
A-25:

QuickCut限制酶酶切时间不宜过长。如果需要延长酶切时间,建议时间不要超过“不产生Star Activity的时间”,具体信息可以参考制品说明书。

Q-26:QuickCut限制酶的反应体系是否可以缩小?
A-26:

不建议缩小酶切反应体系,酶切体系过小可能会影响酶切效果。