| Oligo合成课堂第三期 Oligo的准确定量 |
| 在Oligo的应用中，使用者一般更关注Oligo纯度等因素对实验的影响，往往忽略了一个重要因素：定量。Oligo的准确定量对实验结果的影响也是至关重要的。 |
| 那么，定量不准确到底都有哪些影响呢？（以实时荧光定量PCR使用的引物探针为例） |
| 首先，对Ct值的影响。引物探针添加量不足，往往会造成Ct值滞后的情况，如图一： |
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| 图一 引物探针添加量不足造成Ct值滞后 |
| 其次，对荧光信号值的影响。探针添加量不足或过多，对于最终的荧光信号值也会有比较大的影响。如图二： |
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| 图二 探针添加量较多造成荧光信号值过高 |
| 第三，对融解曲线的影响。当引物设计不是很理想时，加入过量的引物，可能会形成较多的引物二聚体，造成融解曲线双峰，如图三： |
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| 图三 引物添加过多造成融解曲线双峰 |
| 第四，实验结果重复性差。由于不定量或不能准确定量，往往会造成批次间实验结果重复性略差，如图四： |
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| 图四 批间实验结果差异大 |
| 以上是荧光定量PCR实验中比较普遍的现象，定量不准确的影响还有很多。所以，Oligo使用前的准确定量，是保障实验成功和减少实验结果重复性差的一个很重要的因素。Takara有着严格的定量及分装流程，有效控制Oligo批间差，确保质量持续稳定。 |
| 那么，如何对Oligo进行定量？ |
| 目前普遍采用分光光度法，其原理是由于Oligo中的碱基之间存在共轭双键，共轭双键对光具有强吸收的特点，因此当测量吸收光谱时，在波长260nm或接近260nm处都有一个吸光度（Absorbance, A260），通过对吸光度的测定，来对样品进行定量。 测定设备使用比较广泛的是紫外/可见分光光度计，比如：UV-1800、NanoDrop系列等。 Oligo DNA/RNA定量的计算方法也有很多种：有通过A260值和摩尔消光系数计算的，也有通过分子量来计算的。不同计算方法获得的结果之间是有差别的。 |
| 不同的计算方法造成了Oligo DNA/RNA在定量方面存在以下两个问题： |
| 一是系统误差：不同的定量仪器存在系统偏差； 二是计算方法误差：不同的摩尔浓度计算方法存在偏差。 鉴于以上情况，Takara对Oligo DNA/RNA的定量进行了一系列的研讨，希望能够找到更为准确、偏差更小的Oligo DNA/RNA测定和计算方法，避免由于定量不准确造成实验失败和重复性差的风险。 |
| 在定量过程中，一些常用的参数如下： |
| 1、OD：光密度，表示被检测物吸收掉的光密度。 1 ml体积1 cm光程标准比色皿中，260nm波长下吸光度为1 A260的Oligo溶液定义为1 OD，所以OD260值= A260值。 |
| 2、摩尔消光系数(Molar Extinction Coefficient)ε：是指浓度为1摩尔/升时的吸光系数，用 ε 表示。 对于Oligo DNA/RNA，当序列和修饰基团确定的情况下，摩尔消光系数ε也就确定了。 注：该数据在Takara制品包装内附的Oligo Data Sheet上提供。 |
| 3、平均质量：1个OD值的合成DNA/RNA的质量。 1个OD260值的Oligo DNA（ssDNA）的平均质量约为33 μg 1个OD260值的双链DNA（dsDNA）的平均质量约为50 μg 1个OD260值的RNA的平均质量约为40 μg 平均质量依据的是在序列中四种碱基占比一致，即1:1:1:1，但实际上，合成的Oligo产品一般序列较短，比例之间差异较大，因此实际质量与平均质量之间也会有比较大的差异， 例如： 5’-AAA AAA AAA A-3’ 24.88 μg/OD260 5’-GGG GGG GGG G-3’ 31.54 μg/OD260 5’-CCC CCC CCC C-3’ 39.19 μg/OD260 5’-TTT TTT TTT T-3’ 36.52 μg/OD260 因此定量计算过程中，如果引入了平均质量这个参数，那么后续计算得到的浓度会有一定的偏差。 |
| Oligo产品在订购时，常用订购单位为OD，但在实验过程中使用的是摩尔浓度，所以OD与摩尔数之间需要进行换算，常用的换算公式有两种： ①nmol ＝ 106 × OD/ε ②nmol ＝ （OD×33/碱基数×330）103 “33”为1 OD的Oligo DNA的平均质量为33μg “330”为每个碱基的平均分子量按330道尔顿计算。 公式②中两个平均值造成该公式的偏差较大，只能作为粗略计算，因此，更推荐使用公式①。 |
| 为了您使用方便，Takara在产品的包装标签上会注明该最小包装中所含Oligo的OD值和nmols，您可以根据标注的nmols来进行溶解稀释。溶解稀释后的产品，此时所知的浓度为理论浓度，Takara建议您进行复测，以确保使用时添加量准确。 市面上的定量设备很多，使用较为广泛的是Nanodrop系列设备，因此针对Nanodrop设备的测定，Takara进行了研讨，最终确定了较为准确的测定和计算方法。 |
| 1、样品的稀释 |
| 开盖前须先离心，使制品集中于管底；根据需要，使用灭菌水或TE Buffer（pH7.5～8.0）进行溶解（标记探针在TE Buffer中溶解更稳定） 1）根据标签信息将样品稀释至100 μM：将干粉配制成100 μM溶液，加入溶剂的体积为 V(μl)=nmol数 × 10 2）测定前，进一步稀释至合适浓度。如NanoDrop系列设备，建议将测定样品终浓度稀释至10 μM。 |
| 2、测定 |
| NanoDrop系列设备测定设置： |
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| 一般情况下，对于提取的Oligo DNA/RNA样品中会残留一些在320 nm处有吸收的物质（如，核酸类似物、多糖等），所以在进行测定时，需要减去A320的值。因此NanoDrop设备在样品测定页面增加了“基线矫正（Baseline Correction）”功能，旨在用来校正因颗粒光散射引起的任何偏移，测得数据中减去指定基线校正时测得的吸光度。但对于化学合成的有修饰的Oligo DNA/RNA则不需考虑该影响，其本身在260 nm以外的波长下也会有吸收，所以不能进行校正。在测定时，不论样品是否有修饰，选择“单链DNA”模式，不勾选“基线校正”功能，能够获得偏差较小的A260数值。 |
| 3、计算 |
| 通过设备直接测定的A260值来计算测定样品浓度，计算公式如下： Primer摩尔浓度μM = 实测A260值×稀释倍数×106/ 摩尔消光系数ε Probe摩尔浓度μM = 实测A260值×10注1×稀释倍数×106/摩尔消光系数ε 注1：使用NanoDrop2000/2000c设备Micro Array模式测定时，计算时需要乘以10（1 cm光程）；使用NanoDrop One设备测定时，则不需要乘以10。 |
| NanoDrop设备在测定A260的同时会提供质量浓度值，该值是通过“C = A260 ×平均质量”计算得到。在前面平均质量说明中，已详细说明了该参数的偏差，所以不建议使用质量浓度来计算。 |
| 除了准确的定量方法，产品分装、干燥等环节的严格验证，人员的定期培训，设备的定期校正，Takara多方面确保将合格的产品送到您手中。 |
| 实验的成功依靠很多方面，一个小小的细节可能就决定了成败，Takara公司不仅仅注重生产制造的各个环节，对于产品使用的细节也能提供有效的解决方案，为您的实验及生产制造保驾护航。 |
页面更新：2023-11-02 10:35:36
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