| Oligo合成课堂第二期─Oligo的纯化 |
| 上期我们介绍了Oligo的化学合成，亚磷酰胺法是商业化Oligo合成的主流方法。实际合成生产中，不管条件如何，偶联步骤中都会有一些寡核苷酸不会与新引入的核苷酸反应，导致产生短的寡核苷酸链，而且这种短的寡核苷酸链在统计学上会随着每个合成的循环而积累。也正是因为这个原因，限制了可以通过化学合成得到较长长度的、高纯度的寡核苷酸链。目前化学方法合成的Oligo长度一般不会超过200个核苷酸（nt）。而合成的粗产物中，除了反应不完全的短寡核苷酸链，还有反应生成的盐、丙烯腈，脱保护过程中剩余的氨等等。这些“杂质”的存在，不但造成定量不准确，而且有碍下一步的反应，因此合成后的寡核苷酸链需要进一步纯化，为了后续实验应用，选择适当的方法纯化Oligo是十分关键的。 |
| 目前常用的纯化方式有OPC纯化、PAGE纯化和HPLC纯化等。 |
| 固相亚磷酸三酯法，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成，合成方向是由待合成序列的3’端向5’端进行，相邻的核苷酸通过3’-5’磷酸二酯键连接。 |
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| 1. OPC（寡核苷酸纯化柱）纯化 |
| 因OPC中的吸附剂对DMT基团有亲和力，分离的基础是依据目标序列（带有DMT基团）与短序列（没有DMT基团）疏水性的差别。当所有的寡核苷酸链被吸附在色谱柱上后，用有机溶剂洗脱，没有DMT基团的短链Oligo吸附能力弱，很容易就被洗脱下来，而带有DMT基团的目标序列则保留在柱内，从而达到脱盐纯化的目的。最后，利用脱保护步骤将目标序列与DMT分离，收集得到最终的纯化产物。该纯化方式获得的Oligo DNA纯度≥85%（GB/T 34797-2017）。纯化后的产品可用于普通PCR、测序、克隆等实验。 但该方法对于较目标序列短几个碱基的片段，去除效果并不是很好，产率较低。也不适用于40 mer以上的寡核苷酸链的纯化。 |
| 2. PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）纯化 |
| PAGE纯化分离的依据是分子量和电荷，是一种常用的寡核苷酸纯化方式。在电场作用下，不同长度序列的迁移速率不同，通过控制电压和电流，达到分离的目的。另外，分子形状、亲疏水性、分子大小、凝胶基质的相互作用等也能影响分子的迁移速率。 电泳结束后，将分离后的目的条带切胶回收。PAGE纯化具有很高的分辨率，对于N-1的去除非常有效，尤其适合长序列（＞60 mer）的纯化。一般情况下，PAGE纯化的寡核苷酸纯度≥90%（GB/T 34797-2017），有些样品的纯度甚至能够达到95%以上。所以，PAGE纯化寡核苷酸的应用更为广泛，如qPCR、反义核酸、基因芯片、基因合成等方面。 |
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| 图1 PAGE检测结果 |
| PAGE纯化纯度较高，但依赖于人工切胶，不易于实现自动化。并且电泳装置上样量小，限制了PAGE纯化的规模。 |
| 3. HPLC（高效液相色谱法）纯化 |
| 高效液相色谱法（HPLC）将寡核苷酸的定量分析和纯化结合起来。根据分子的亲水性（反相）和电荷（离子交换）方面的差异分离目标寡核苷酸。HPLC纯化和OPC纯化方法在原理上颇为接近，也是利用5'端DMT保护基团与其他不带保护基团的Oligo在色谱柱上吸附能力不同达成分离纯化的目的。在洗脱过程中，可以通过改变液体流动相中不同组分的配比来实现梯度洗脱。 HPLC用于寡核苷酸纯化主要有两种方法：阴离子交换色谱法（IE-HPLC）和反相色谱法（RP-HPLC）。 IE-HPLC是在既定的pH条件下，根据不同组分的离子电荷情况和等电点的不同，将其分离开来的一种液相色谱技术。DNA分子带负电，而固定相带正电。当样品进入色谱柱后，与固定相树脂形成电荷相互作用。较长的片段由于带有更多的电荷，与树脂的电荷相互作用力更大，流动速度慢。当短片段流出色谱柱时，长片段依然在色谱柱内，最后用洗脱液将目标序列洗脱。 RP-HPLC是一种采用非极性键合固定相，以及极性强于固定相的溶剂系统为流动相的液相色谱分离形式。反相色谱固定相表面键合疏水基团。样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的强弱不同：极性较强或亲水的样品分子与固定相之间相互作用较弱，容易被洗脱；而极性较弱或疏水的分子与固定相之间有较强的相互作用，保留时间较长。这一方法使得分离过程中带有DMT基团的全长目的序列容易与不带DMT基团的短序列分离。 高效液相色谱法（HPLC）的优点是自动化水平高、可定量分离产品、容易回收纯品、分辨率高。HPLC纯化的寡核苷酸纯度≥95%（GB/T 34797-2017）。 |
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| 图2 HPLC纯度检测结果 |
| HPLC纯化产物由于纯度高、产率高，所以在生物领域的应用非常广泛，也是生物企业大批量生产选择的主要纯化方式。 |
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各应用领域使用的Oligo产品对纯度的要求不尽相同，纯度未必是越高越好，选择合适的纯化方式才是性价比最高的。 |
| 除了不同的纯化方式对纯度的影响以外，Oligo长度、特殊序列（形成高级结构）等因素，也会影响最终的产品纯度。因此，对于一些特殊样品，Takara公司会根据实际情况优选解决方案，使用但不限于以上单一的纯化方式，PAGE、HPLC、甚至双纯化；提供但不限于国标要求纯度的产品。一些检测试剂盒等对Oligo的纯度要求很高，Takara公司有特殊定制服务，可提供超越国标要求纯度的产品。提供客户满意的优质的产品是Takara不变的服务宗旨。 |
页面更新：2023-11-02 10:35:28
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