| Oligo合成课堂第一期 Oligo的化学合成 | |||||||||
| · Oligo合成技术发展史 | |||||||||
| Oligo即寡核苷酸链，在生物学各领域中应用非常广泛，我们常用的测序引物、PCR & qPCR的引物探针、NGS捕获探针、FISH探针等都属于Oligo范畴。根据功能不同，可以在Oligo上修饰荧光基团、淬灭基团和化学基团（如，氨基、巯基等）等。 DNA合成技术是合成生物学及生物制造领域的关键底层共性技术。Oligo的化学合成始于20世纪50年代： |
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| · Oligo合成步骤 | |||||||||
| 固相亚磷酸三酯法，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。该方法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成，合成方向是由待合成序列的3’端向5’端进行，相邻的核苷酸通过3’-5’磷酸二酯键连接。 | |||||||||
1、脱去DMT基团：使用二氯乙酸或者三氯乙酸的二氯甲烷溶液去除预先连接在固相载体上的末端核苷酸的5'-DMT保护基团，暴露5'-OH，以供下一步偶联。 2、偶联：待合成的亚磷酰胺单体与活化剂四唑混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体，它的3’端被活化，5’-羟基仍然被DMT保护；脱保护的5'-OH会与亚磷酰胺四唑活性中间体发生偶联反应，形成亚磷酸三酯键，在这一步核苷酸链得到延伸。 3、带帽（capping）反应：虽然偶联的效率可以达到99%以上，但仍有一些已经脱保护的5'-OH没有参与反应。为了防止这些5'-OH与下一个循环加入的亚磷酰胺单体发生偶联反应，产生N-1杂质，需要对未参与偶联的5'-OH加帽。一般常用乙酸酐和N-甲基咪唑形成乙酰化试剂，与未参与偶联反应的 5'-OH形成酯键。 4、氧化：偶联反应生成的亚磷酯键易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。 通过上述步骤，一个脱氧核苷酸就被连接到固相载体的核苷酸上了。再重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被连接上去。 5、切离、脱保护：将连接在CPG上的引物切下来，再经过高温处理，脱去碱基上氨基的保护基团。 6、纯化：切下来的Oligo粗品根据实验目的不同选择不同的纯化手段进行纯化。 |
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| 由于随着链延长所带来的化学反应效率、合成纯度以及产率的下降，目前化学方法合成的Oligo长度一般不会超过200个核苷酸（nt）。 | |||||||||
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| 化学合成技术发展至今，技术越来越成熟，合成效率也在不断提高，柱合成、高通量合成都获得了长足的发展。 | |||||||||
| · Takara Oligo合成的优势 | |||||||||
| 对核酸合成来说，最为重要的因素包括：合成用的核酸单体、合成用的固定相载体，以及合成过程的工艺参数控制。 Takara采用进口的先进合成仪，能够进行单柱合成及高通量合成，满足不同引物、探针的制造需求： |
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| 优质的原材料才能获得高质量的产品， Takara合成的主要原料均为进口原料，奠定了我们高品质产品的基石。 很多化学合成原料对环境的温度和湿度较敏感，通过对实验室温湿度控制，减少环境对原料和偶联反应的影响，提高生产效率，有效的保障产品质量的稳定性。而纯化过程在Cleanroom中进行，可以满足较高的防污染需求。 宝生物工程（大连）有限公司通过了ISO13485认证，所有的制造流程都严格遵守标准操作程序，满足IVD企业的生产需求。 经验丰富的技术人员、先进的设备、优质的原料、严格的生产流程、精细的环境控制，从人机料法环全方位提升才是立足市场的有力保障。 |
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| Takara有着近三十年的合成历史，在Oligo DNA/RNA合成，特别是各种修饰与标记DNA/RNA的合成方面积累了丰富的经验。 我们能够提供单批次2-30,000 OD的高质量引物探针，日产能达到30,000 OD。大规模合成能力，满足客户大量生产需求，减少批间差。 我们目前合成的修饰品种多达200多种，并且还在不断的增加中。除了普通的测序引物、PCR & qPCR的引物探针合成以外，NGS测序引物、FISH探针、LNA、MGB-E修饰双标记探针，以及双淬灭探针等等Oligo的合成，Takara都有成熟的制造工艺，满足客户需求。同时Takara推出定制化生产线，对客户的特殊要求提供定制合成服务。 目前我们可将HRP（辣根过氧化物酶），链霉亲和素及人工合成多肽连接到Oligo DNA链上；解决了rApp修饰接头标记效率低等问题，提供高质量的small RNA高通量测序文库腺苷酸化接头；G丰富序列，甚或Poly G序列等，我们也有着有效的解决方案。 |
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| 寡核苷酸和长核苷酸的合成取得了惊人的进展。DNA合成的更快周转时间、更高准确性和成本的急速下降已经成为可能，这种趋势一定会在未来继续下去。 | |||||||||
| 附： Takara Oligo合成list |
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页面更新：2023-07-05 16:31:33
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