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当前位置:首页> 产品选择指南 > cDNA合成 & 克隆 > 克隆学习中心 > 灵活巧妙的SMARTer RACE方法
SMARTer技术——升级的全长cDNA合成方法
 
众所周知,一个基因会不只编码一个蛋白质。所以,为了得到同一个基因转录的不同转录本的更多信息,获取5'-和 3'-序列信息是很重要的。通过全长cDNA可以得到这些末端序列的特异信息,这样可以了解到关于转录变异体的更好的数据。研究者经常通过Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE)来获取RNA转录子的全长序列。如果您只研究几个基因,那么RACE是比下一代测序(NGS)更经济的方法。
SMARTer RACE 5'/3' Kit(Code No. 634858/59)是优化升级的试剂盒,具有更高的灵敏、更低的背景和更高的特异性。采用SMART技术,以poly A+ 或总RNA为起始,合成的第一链cDNA可直接进行5′和3′RACE-PCR,不需要adaptor连接等步骤,整个流程更快、更易操作。SMART RACE 还结合了强有力的抑制性PCR,显著地减少了RACE实验中的弥散现象,是获得全长cDNA的有效方法。
 
图1. SMARTer cDNA合成的原理。使用修饰的oligo (dT)引物进行第一链合成,SMARTScribe反转录酶到达mRNA模板末端之后,会自动添加几个非模板的碱基,SMARTer II A Oligonucleotide会与cDNA尾部结合,作为SMARTScribe反转录酶的模板进行进一步的延伸。
 
图2. SMARTer RACE 5'/3' kit流程示意图。每个试剂盒即一个完整的系统,包含了第二天克隆RACE片段的全部试剂。
 
SMARTer cDNA合成方法的优势
 
 
SMARTer RACE方法:一个试剂盒即可完成合成,克隆,确认
 
SMARTer RACE 5'/3' Kit(Code No. 634858/59)包含了除基因特异性引物外的所有组分,流程更精简。使用这一个试剂盒,即8小时内完成第一链cDNA合成到克隆RACE片段的流程,并在第二天就可以挑取克隆进行分析(图 2)。
除了核心SMARTer试剂,试剂盒还包含了性能优良的SeqAmp DNA Polymerase,对于长片段或高GC含量等高难度片段的扩增也适用。(图 3, 表1)。
 
图3. 升级版RACE试剂盒与旧版产物对比。引物根据说明书中推荐方法设计。通过电泳图上可以看出检测到宽广范围内的表达值,合计外显子长度大于10 kb。目标基因的确认、长度和GC含量在表1中显示。升级版试剂盒可以更成功地扩增出单一清晰条带。
 
SMARTer RACE 5'/3' Kit包含了NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit用于纯化PCR产品, 高效无缝克隆In-Fusion HD Cloning Kit, 高效率感受态细胞Stellar Competent Cells。由SeqAmp DNA Polymerase扩增的PCR片段是平末端,可更好地使用In-Fusion方法进行克隆,即使片段较大的情况下,In-Fusion方法的克隆效率也很高。
试剂盒中还包含了兼容In-Fusion方法的线性化克隆载体,试剂盒中的引物是与该载体引物特异性匹配的。您需要按照说明书中的指南来设计基因特异性引物,这样才能保证特异性地克隆目标5'-或3'-RACE片段。
共同使用这些试剂,SMARTer cDNA合成技术和In-Fusion克隆技术的高效性创造了一个极其快速、优化的系统,在两天内即可由RNA获得成功的克隆,用于后续分析。
 
 
表1. 使用升级版试剂盒扩增的5'-RACE片段数据。图3左侧电泳图中的扩增子使用SMARTer RACE 5'/3' Kit中克隆相关试剂克隆并测序,并比对检测到了额外的之前没有注释的碱基信息(表中最右列)。
 
SMARTer RACE方法的新应用
>> 抗体可变区的快速克隆
 
>> SMARTer RACE在CAR-T研究中的应用
 
>> LncRNA未知序列调取