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重组蛋白疫苗研究解决方案

 
关于SARS-CoV-2的疫苗研究,识别可能引发对该病毒的免疫反应的抗原决定簇,这是开发新疫苗的重要一步。Takara Bio提供了一系列创新技术来支持这项工作。疫苗的研发包括利用测序和生物信息学分析病毒及宿主基因组以确定潜在的靶标,克隆和分离候选抗原决定簇,测试动物模型的免疫反应,最后对主要候选对象进行临床试验。
 
 

 
病毒与宿主的基因组学
SARS-CoV-2病毒的全基因组测序,可以提供有价值的有关可能引发免疫反应的潜在抗原决定簇信息。Takara Bio的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian在中国已用于SARS-CoV-2测序,以获得病毒的全基因组序列。通过对COVID-19感染者或康复者进行免疫分组库分析,可为进一步促进抗原和疫苗靶标识别提供更多信息。高灵敏度的SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling KitSMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2可用于监测从感染到康复过程中BCR(B细胞受体)和TCR(T细胞受体)的克隆型变化。
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
· 250 pg-10 ng 的total RNA起始量,样本稀少也能高效建库!
· 专为低质量样本设计,无需进行rRNA前处理操作!
· 随机引物起始,6小时内即可制备高质量文库!
SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit
· 可从外周血单核细胞(PBMC)纯化的10 ng-1μg的总RNA或从B细胞纯化的1-100 ng的总RNA起始,正确扩增并通过测序鉴别人IgG亚类
· 添加UMI,可校正来自PCR错误、重复序列以及序列错误的读取
SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2
· 支持total RNA(10 ng-1 μg外周血淋巴细胞来源或 1 ng-100 ng T细胞来源 total RNA),或者纯化后完整的T细胞(1,000-10,000个)起始
· 每次反应仅需一对引物扩增相应的TCR亚基
· 引入UMI建库,校正PCR偏差及测序错误产生的reads
   
  已有研究人员在针对SARS-CoV-2研究过程中使用了SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian ,这些工作现已发表:
  · Wu, F. et al., A new coronavirus associated with human respiratory disease in China . Nature. Mar;579(7798):265 269. (2020)
· Lu, Jing et al. Genomic Epidemiology of SARS CoV 2 in Guangdong Province, China. Cell vol. 181,5
· Pfefferle, Susanne et al. Complete Genome Sequence of a SARS CoV 2 Strain Isolated in Northern Germany. Microbiology resource announcements vol. 9,23 (2020)
 

 
生物信息学分析
接下来的一步是对病毒基因组和宿主的BCR和TCR免疫组库进行生物信息学分析,以揭示SARS-CoV-2的抗原,并选择疫苗靶标(病毒表面受体)。Takara Bio的Immune Profiler Software可与SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit配合使用,以分析有关克隆型数量和可变区V(D)J序列的信息。
 

 
疫苗靶标的克隆
研究人员可以利用Cloning Enhancer,质粒纯化试剂盒,Stellar感受态细胞以及In-Fusion无缝克隆技术来进行高通量克隆,从而加快病毒受体和疫苗载体的构建:
· 高效——对于0.5~15 kb的插入片段,克隆效率可超过95%
· 不依赖序列——可在任意载体的任意位置进行任意片段的克隆
· 无缝连接——克隆连接处无多余的碱基对(或疤痕序列)
· 一盒多用——只需一个试剂盒就可进行多片段克隆和定点诱变
 
已有研究人员在研发针对冠状病毒(包括SARS-CoV-2)疫苗的过程中使用了In-Fusion克隆技术,这些工作现已发表:
· Kato, H. et al. Development of a recombinant replication-deficient rabies virus-based bivalent-vaccine against MERS-CoV and rabies virus and its humoral immunogenicity in mice. PLoS One. 14, DOI:10.1371/journal.pone.0223684 (2019).
· Letko, L., Marzi, A., & Munster, V. Functional assessment of cell entry and receptor usage for SARSCoV-2 and other lineage B betacoronaviruses. Nat. Microbiol. 6, 562-569 (2020).
· Terada, Y., Kawachi, K., Matsuura, Y., Wataru, W., Kamitani, W. MERS coronavirus nsp1 participates in an efficient propagation through a specific interaction with viral RNA. Virol. 511, 95-105 (2019).
 

 
表达和纯化疫苗靶标
您可以使用BacPAK杆状病毒表达系统来表达您感兴趣的蛋白质,以用于疫苗开发。该技术易于扩大规模,蛋白质表达水平高,对人体无致病性。此外,该系统产生的靶蛋白在结构、生物活性以及免疫反应性方面与天然蛋白质都是相似的。为了优化重组蛋白质的表达水平,可以使用BacPAK Baculovirus Rapid Titer Kit快速确定病毒的滴度,该试剂盒使用标准免疫测定法在48小时内即可准确测定杆状病毒滴度,而斑块和终点稀释测定法通常需要5-10天。一旦靶蛋白从这些纯化的产物中表达出来,就可以使用我们的Capturem新型高容量膜纯化技术来快速纯化His标签标记的疫苗候选蛋白:
· 快速、方便的工作流程——Capturem膜上偶联镍离子作为配基,使用方便的纯化柱/纯化板/过滤装置,室温下操作仅需5-30分钟
· 高纯度——柱床体积小,带入污染少
· 兼容多种添加剂——包括EDTA、DTT、BME、甘油、TCEP等(兼容试剂一览表
· 通用性——易于从哺乳动物/细菌的细胞裂解液和上清液中纯化
 
已有研究人员在疫苗开发工作中使用我们的Capturem His技术发表了研究成果:
· Do, V. T. et al. Recombinant adenovirus carrying a core neutralizing epitope of porcine epidemic diarrhea virus and heat-labile enterotoxin B of Escherichia coli as a mucosal vaccine. Arch. Virol. 165, 609-618 (2020).
· Martínez-Hernández, S. L. et al. An anti-amoebic vaccine: generation of the recombinant antigen LC3 from Entamoeba histolytica linked to mutated exotoxin A(PEΔIII) via the Pichia pastoris system. Biotechnol. Lett. 39, 1149-1157 (2017).
 

 
使用疫苗靶标对小鼠进行免疫反应,筛选血清的抗病毒活性,并优化有前景的候选对象
Takara Bio的SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling KitSMARTer Mouse TCR a/b Profiling Kit可用于通过监测BCR和TCR克隆型的多样性变化,加快针对目标疫苗的抗病毒活性的免疫血清筛选过程。通过分析和比较接种动物在感染病毒之前和之后的抗体和T细胞反应,进一步优化了有前景的候选疫苗。
SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit
· 支持10 ng-3 μg来自于脾脏、淋巴结、PBMCs 及杂交瘤的总RNA起始
· 在大多数情况下,可以有效扩增并通过测序鉴别小鼠IgG亚类
· 可以高灵敏度地从同一样品中检测不同链
SMARTer Mouse TCR a/b Profiling Kit
· 支持10 ng 至500 ng的来源于小鼠脾脏、胸腺或PBMCs的总RNA起始,也可以1,000 至 10,000个纯化的T细胞起始
· 可获得TCR mRNA转录本可变区的全长序列
· 可同时或单独分析TCR两个亚基的多样性
· 无需多重PCR,每次反应利用一对引物扩增相应的TCR亚基
 

 
评估选定的最终候选疫苗在临床试验中的有效性
监测免疫反应是评估最终候选疫苗有效性的关键。通过NGS对BCR和TCR进行序列分析,可以正确监测克隆型的变化,并识别疫苗特异性的克隆型。
 
【产品一览表】
Code No. 产品名称 包装量
  新一代测序相关
634411 SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian 12 Rxns
634466 SMARTer Human BCR IgG IgM H/K/L Profiling Kit 12 Rxns
634478 SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit v2 12 Rxns
634422 SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit 12 Rxns
634402 SMARTer Mouse TCR a/b Profiling Kit 12 Rxns
  表达和纯化相关
631406 BacPAK Baculovirus Rapid Titer Kit 5 Assays
631414 BacPAK qPCR Titration Kit 200 Rxns
635710 Capturem His-Tagged Purification Miniprep Kit 20 Purifications
635713 Capturem His-Tagged Purification Maxiprep Kit 6 Purifications
635715 Capturem His-Tagged Purification Maxiprep Columns 25 Columns
635719 Capturem His-Tagged Purification Maxiprep Columns 50 Columns
635714 Capturem His-Tagged Purification 96 1×96 well plate
635724 Capturem His-Tag Large Volume 4 Units
(2 Units per box)
635730 Capturem His-Tagged Purification 24-Well Plate 1×24 well plate
  克隆相关
639650 In-Fusion® HD Cloning Kit 100 Rxns
638920 In-Fusion® HD Cloning Plus 96 Rxns
639691 In-Fusion® HD EcoDry Cloning Kit 96 Rxns
638912 In-Fusion® HD EcoDry Cloning Plus 8 Rxns
新品In-Fusion® Snap Assembly升级体验,更多的阳性菌落数和更高的克隆效率,欢迎选购。