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基因敲入用长单链DNA制备 v1
品牌 Code No. 产品名称 包装量 价格(元) 说明书 数量
Clontech 632644 Guide-it Long ssDNA Production System 25 Rxns ¥5,654
Clontech 632645 Guide-it Long ssDNA Strandase Kit 25 Rxns ¥4,159
 
基因敲入用长单链DNA制备
CRISPR/Cas9和其它基因编辑工具已经被成功应用于获得基因敲除突变(knockout),但众多事实证明在基因敲入上的应用有很大的难度。基因敲入所面临的主要难题是修复模板的制备和如何与Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物共导入至细胞。
虽然单链DNA(ssDNA)修复模板展示出了优于双链DNA(dsDNA)模板的众多优势,但是其制备难度和制备费用都有很大的挑战性,因而限制了长单链DNA(long ssDNA)模板的应用。Guide-it Long ssDNA Strandase Kit可以很好地解决这个矛盾,可制备长达5 kb的ssDNA寡核苷酸,应用于CRISPR/Cas9或者其它基因编辑技术作为基因敲入实验修复模板。本试剂盒提供了一种简便的方法通过有选择地消化降解双链DNA PCR产物的正义链(sense strand)或者反义链(antisense strand),将其转化为单链DNA。该试剂盒提供了可以制备50条ssDNA链的足量试剂(25对正义链和反义链)。
 
与dsDNA相比,使用ssDNA作为模板的优势:
· 显著降低了随机整合到基因组中的概率,从而提高了基因编辑效率
· ssDNA模板导入产生的细胞毒性反应低
· 不存在随机整合或者表达,提高了基因编辑效率
· 非整合模板中不表达,更容易识别发生正确基因编辑的细胞克隆
注意:Guide-it Long ssDNA Production System包含NucleoSpin Gel 和 PCR Clean-up kit,用于在基因编辑实验之前纯化strandase反应液。
 
■ Overview
· 制备长达5 kb的长单链DNA(ssDNA)供体模板
· 三步操作,快速,简便易用
· 不存在随机整合或者表达,从而提高了基因编辑效率
· 单链DNA供体模板产生的细胞毒性远低于双链DNA模板
 
■ 应用
· 制作基因敲入实验供体模板,DNA片段> 500 bp
 
■ 操作流程概要
图1. 同源定向修复(Homology Directed Repair)实验用长单链DNA(long ssDNA)供体模板制备步骤示意图。第一步,通过合适的方法(克隆,融合PCR等)制作dsDNA起始模板,dsDNA模板包含与目的插入位点两侧同源的同源臂,模板中间是欲knockin的外源序列。第二步,通过在第一步中产生的dsDNA的不同位置上结合磷酸化的引物,制备出两种不同的dsDNA作为Strandase反应的底物。添加Strandase Mix A,开始消化降解正义链或反义链(Strandase Mix A有选择性地降解磷酸化的DNA链)。第三步,添加Strandase Mix B完成降解反应,从而获得ssDNA。最后,纯化ssDNA产物用于knockin实验。我们建议制备ssDNA正义链和ssDNA反义链并独立用于knockin实验。
 
 
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