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当前位置:首页> 解决方案 > 抗体药物筛选解决方案 > 抗体药物筛选解决方案 > 方案四:质谱检测前抗体的快速酶解消化
 
质谱检测前抗体的快速酶解消化
质谱(MS)是蛋白质组学中对来自多种生物和细胞类型的蛋白质进行表征分析的主要技术,随着LC-MS/MS技术在蛋白质类药物生物分析领域的应用,已可将方法开发周期从以前的2-3个月缩短为1周,而使用质谱对抗体药物进行准确的定性以及定量也已经成为抗体药物研发过程中必不可少的环节。
质谱分析中最重要的步骤是样品制备,需要将蛋白质转化为肽。胰蛋白酶的使用是酶解消化蛋白质以制备肽进行分析最常用的手段。它是一种高度特异性的丝氨酸蛋白酶,在赖氨酸和精氨酸残基的羧基侧切割,产生MS分析最佳大小的肽。因此,快速和完全消化对于详细的蛋白质表征分析非常重要。
目前传统的样品制备操作是在溶液中37℃过夜进行胰蛋白酶消化。蛋白质的长时间消化可能造成氧化或其他蛋白质修饰,导致灵敏度差,从降低了溶液内消化的可重复性,并且也不适合自动化平台。此外,产生的信号肽的多少以及长短会直接影响到检测方法的准确性和灵敏度,从而影响了对抗体的定量及鉴定。
Takara的Capturem Trypsin和Pepsin可快速、有效、完全地消化蛋白质样品,在室温下让MS工作流程更加连贯。该系列产品应用我们的新型Capturem膜技术,膜上固定有胰蛋白酶(Trypsin)或胃蛋白酶(Pepsin),仅需2-3分钟的时间即可高效消化蛋白质样品,能进行独立样品酶解,也可进行96-well的高通量酶解操作。不仅可以节省时间,还可以通过减少胰蛋白酶自溶来改善蛋白质组学分析中肽和蛋白质的鉴定。
 
【实验案例】
Capturem Trypsin消化全细胞裂解物的蛋白质组学分析
 
Protein amount per fraction used for Capturem Trypsin digestion
Fraction Protein amount (μg) Fraction Protein amount (μg)
1 32.22 11 35.19
2 35.08 12 33.12
3 33.75 13 26.88
4 41.76 14 31.88
5 41.76 15 29.41
6 38.21 16 26.48
7 38.21 17 25.98
8 38.40 18 24.63
9 30.32 19 21.48
10 35.23    
 
使用Capturem Trypsin对由BT474导管乳腺癌细胞制成的全细胞裂解物进行蛋白质组学分析,以尽可能多的鉴定独特蛋白质。变性的全细胞裂解物通过RP-HPLC(上图, A)被分成独立的19份,对每份用Capturem Trypsin消化。上表中提供了使用Capturem Trypsin消化的每份的蛋白质含量。针对每份消化的蛋白质进行单独的LC / MS-MS分析。上图,B显示了每份样品鉴定得到的独特的蛋白质的数量。最终,使用Capturem Trypsin对BT474细胞酶解消化后进行蛋白质组学分析共鉴定得到了2,320种独特蛋白质。
 
Capturem Trypsin在进行高通量酶解消化时的孔重复性
随机选取Capturem Trypsin 96 well plate的3个孔,在天然条件下消化80 μg的apomyoglobin,消化过程仅用了2-3 min。由上图可见,3个孔的酶解产物生成了相似的HPLC图谱,这说明Capturem Trypsin酶解消化的产物具有良好的重复性,进而证明产品具有良好的孔间一致性,非常适合质谱检测前抗体的高通量酶解消化。
 
【用户感言】
Dr. Michelle R. Robinson来自美国默克(MERCK) 制药公司,默克研究所药代动力学及药效动力学部门。
他在研究简报中提到,免疫亲和纯化和酶消化处理是使用金标准“自下而上(bottom-up)”法进行LC-MS分析前,广泛使用且至关重要的样品处理步骤。如果应用Capturem技术进行免疫亲和纯化和酶消化处理,将大大缩短实验操作时间。他以两种单克隆抗体标准品为样品,使用Capurem进行免疫亲和纯化和酶解消化,再进行LC-MS定量分析以评估Capturem的使用效果,结果酶消化步骤由传统溶液法的4-18 hr缩短成3 min,而使用原有的自动操作系统进行免疫亲和纯化最快也需要2 hr,使用Capturem则仅需5 min。除此之外,Capturem还能够显著增加实验通量达10-20倍。
Takara的SMARTer cDNA合成技术、In-Fusion克隆技术以及Capturem 膜技术在抗体药物研究领域的应用,大大缩短了药物在筛选和DMPK研究阶段的实验周期,为实现药物研发与疾病“赛跑”提供了可能!
 
 
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页面更新:2019-11-27 14:20:42