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当前位置:首页> 解决方案 > 抗体药物筛选解决方案 > 抗体药物筛选解决方案 > 方案一:快速调取抗体可变区scFv序列
 
快速调取抗体可变区scFv序列
 
由于抗原抗体结合的特异性取决于抗体可变区的特异结构,所以分析可变区的序列是很多应用的第一步,这包括以噬菌体展示技术(用PCR技术从人免疫细胞中扩增出整套的抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,克隆到噬菌体载体上并以融合蛋白质的形式表达在其外壳表面)为核心的大规模单抗筛选工作,以及对可变区结构进行稳定优化的抗体改造等工作。
分析可变区时,设计一个通用引物来扩增所有抗体序列是非常困难的,因为重链和轻链5’端的天然可变性决定了序列同源性很低,一个有效的方法是在可变区下游的保守区设计简并引物,后续使用5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)的方法克隆这段目的区域,之后再进行测序。但普通的RACE方法常有扩增序列较短或操作步骤繁琐的缺点,因此错过了重要信息。
Takara的SMARTer RACE cDNA合成技术可为抗体可变区的全长序列分析提供简单、灵敏、高效的解决方案。SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒,结合了Clontech特别的SMARTer(5'末端RNA模板转换机制)技术,允许反转录酶达到转录本的5'末端,不需要adaptor连接等步骤,整个流程更快、更易操作,有效合成全长cDNA,大大减少了非特异性背景并提高了扩增效率。
 
实验案例
● 快速克隆小鼠杂交瘤IgG抗体ORF
在克隆小鼠杂交瘤抗体基因之前,首先根据NCBI核酸数据库注册的小鼠lgG的序列,设计了针对H链, L (κ)链,或L (λ)链的反转录引物(RT Primer)以及RACE PCR所需的反向引物(5' RACE Primer)。通过SMARTer RACE 方法从total RNA合成了第一链cDNA后,直接进行5'-RACE PCR,这样不仅可以获得5'端序列,还可以获得带有可变区全部序列的cDNA片段。
培养并确认小鼠杂交瘤细胞分泌由γ2a型重链和κ型轻链组成的单克隆抗体。提取total RNA,按照说明书protocol进行第一链cDNA合成和5'-RACE PCR,取一部分PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳确认。
克隆扩增产物至pUC118后测序。确认序列包含单克隆抗体H链和L链N端氨基酸序列对应的ORF。
 
 
我们对其他六种杂交瘤细胞系的抗体可变区进行同样的基因序列分析。获得了所有抗体亚类的PCR产物。分析序列后显示,90%的H链克隆和50%的L链克隆序列准确编码目标抗体蛋白质N端氨基酸序列。
 
【应用SMARTer技术保护熊猫免遭灭绝】
 
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页面更新:2019-11-27 14:20:04