人诱导多能干细胞(Human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)是一个功能强大的研究工具和疾病模型,因为其具备增殖、自我更新、分化为多种细胞类型的能力。此外,人iPS细胞还可以再现细胞来源个体的疾病表型和基因型。将人iPS细胞结合基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术,可以在同基因的细胞系中研究特定基因改变引起的功能影响,因为基因编辑过的人iPS细胞能提供可再生的、无遗传变异的患病细胞和健康细胞资源。
CRISPR/Cas9系统已经成为一个强大的基因编辑工具,因为其高的靶向特异性,编辑效率和易用性。该技术的强大主要源于它的简单,因为全部只需要一个Cas9核酸酶结合一个单链向导RNA(single guide RNA,sgRNA) 就可以决定靶向特异性(Jinek et al. 2012)。这种RNA编程的(RNA-programmable)方法利用了非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ) DNA修复途径的易错特性,进而产生基因敲除(通过插入/删除)。这种方法也可以通过同源重组(homology-directed repair,HDR)途径被用于基因敲入。 |
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CRISPR/Cas9系统的组件可以通过多种方法成功导入至靶细胞,包括基于载体的表达系统,RNA转染, 导入Cas9/sgRNA核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)复合物(Sander and Joung 2014)等。与基于载体的方法相比,直接导入Cas9/sgRNA RNPs提供了一种快速转入基因编辑实验的方法,同时脱靶效应的可能性更小(Kim et al. 2014)。 |
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一旦Cas9/sgRNA RNP复合物被导入,为了分离和筛选感兴趣的基因型,单细胞必须被分离并扩增为克隆细胞系。传统上,从基因编辑的hiPS细胞建立一个克隆群是低效的、具有挑战性的和耗时的,因为hiPS 细胞是以集落生长和传代的。通常,这会导致细胞死亡和提前分化。然而,Cellartis基因编辑和单细胞克隆系统包含一个成分确定的培养系统(由基础培养基,包被剂,和添加剂组成),用于有效形成单细胞克隆和扩增基因编辑后的hiPSC克隆。DEF-CS culture system (Asplund et al. 2016)是一个基于单层培养的系统,规避了集落状培养带来的挑战,允许单细胞传代和促进接种的单细胞存活和后续扩增。 |
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Cellartis iPSC Single-Cell Cloning DEF-CS Culture Media Kit (Code No. Y30021) 是一个完整的,在无饲养层和成分确定条件下,用于hiPSCs有效扩增和扩大生产的系统。试剂盒包含了从接种单细胞至96孔板到扩增至48孔板过程中所有必要的试剂。单细胞克隆扩增后,hiPSCs可以使用Cellartis DEF-CS 500 Culture System (Code No. Y30010)继续培养。 |
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Cellartis iPSC rCas9 Electroporation and Single-Cell Cloning System (Code No. 632643) 是一个完整的系统,允许通过电穿孔的方法对hiPSCs进行有效的基因编辑以及随后的单细胞克隆形成和扩增至48孔板。该系统中提供了重组Cas9蛋白质,以及产生大量sgRNAs所有必要的试剂,用于电穿孔hiPSCs。系统中也包括Cellartis iPSC Single-Cell Cloning DEF-CS Culture Media Kit (前面所述) 组份,用于进行基因编辑后的单细胞克隆形成和扩增。单细胞克隆扩增后,hiPSCs可以使用Cellartis DEF-CS 500 Culture System (Code No. Y30010)继续培养。 |
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Cellartis iPSC CRISPR/Cas9 Gesicle and Single-Cell Cloning System (Code No. 632642)是一个完整的系统,允许通过gesicle导入Cas9/sgRNA复合物进行有效的基因编辑随后的单细胞克隆形成和扩增至48孔板。Gesicles是一种无毒的、高效的、替代电穿孔的方法,不依赖昂贵的设备或耗材。系统中提供所有的必要试剂用于产生细胞衍生的纳米囊泡(称做gesicles),来转导Cas9和sgRNA至hiPSCs。系统中也包括Cellartis iPSC Single-Cell Cloning DEF-CS Culture Media Kit(前面所述)组份,用于进行基因编辑后的单细胞克隆形成和扩增。单细胞克隆扩增后,hiPSCs可以使用Cellartis DEF-CS 500 Culture System (Code No. Y30010)继续培养。 |
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■ 产品特点 |
· Highly efficient gene editing in hiPSCs—use either electroporation or gesicles to deliver Cas9 protein and sgRNA with no genomic integration and reduced off-target effects
· Superior single-cell survival—edited hiPSCs exhibit high (typically ~50%) survival when seeded as single cells in a 96-well plate
· Maintenance of pluripotency after editing and during single-cell cloning—hiPSCs maintain high levels (>90%) of pluripotency markers Oct-4, TRA-1-60, and SSEA-4
· Stable karyotype from start to finish—maintain a normal and stable karyotype throughout editing, single-cell cloning, and expansion
· Flexibility to perform gene editing experiments your way—choose from complete kits that provide editing and single-cell cloning solutions using either electroporation-based (Code No. 632643) or gesicle-based (Code No. 632642) CRISPR/Cas9 techniques, or utilize the culture media kit (Code No. Y30021) to perform efficient single-cell cloning following your own editing experiments
· Continuous use of DEF-CS technology throughout gene editing/single-cell cloning experiments—use the Cellartis DEF-CS 500 Culture System (Code No. Y30010) before and during gene editing experiments, then during scale-up after single-cell cloning experiments |
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■ 产品组成 |
Cellartis® iPSC Single-Cell Cloning DEF-CS™ Culture Media Kit
(Code No. Y30021,1 kit) |
· Cellartis DEF-CS 500 Basal Medium (Code No. Y30011; 500 ml)
· Cellartis iPSC Single-Cell Cloning DEF-CS COAT-1 (Code No. Y30018; 2 × 800 μl)
· Cellartis iPSC Single-Cell Cloning DEF-CS Additives
(Code No. Y30019; 2 × 750 μl, 1 × 500 μl, 1 × 500 μl)
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Cellartis® iPSC rCas9 Electroporation and Single-Cell Cloning System
(Code No. 632643; 1 system) |
· Guide-it™ sgRNA In Vitro Transcription Kit (Code No. 632635; 1 kit)
· Guide-it™ Recombinant Cas9 (Electroporation-Ready) (Code No. 632641; 100 μg)
· Cellartis® iPSC Single-Cell Cloning DEF-CS™ Culture Media Kit (Code No. Y30021; 1 kit)
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Cellartis® iPSC CRISPR/Cas9 Gesicle and Single-Cell Cloning System
(Code No. 632642;1 system) |
· Guide-it™ CRISPR/Cas9 Gesicle Production System (Code No. 632613;1 kit)
· Cellartis® iPSC Single-Cell Cloning DEF-CS™ Culture Media Kit (Code No. Y30021;1 kit)
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