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CRISPR/Cas9基因敲入用长单链DNA制备
品牌 Code No. 产品名称 包装量 价格(元) 说明书 数量
Clontech 632644 Guide-it Long ssDNA Production System 25 Rxns ¥5,654
Clontech 632645 Guide-it Long ssDNA Strandase Kit 25 Rxns ¥4,159
无标题文档
 
 
            基因敲除    
        基因敲入     编辑效率检测 细胞基因型确认 Indel序列确认
sgRNA设计工具 sgRNA合成及筛选 Knockin模板制备 CRISPR-Cas9导入方法            
  基因敲入        
        *建议与重组Cas9
蛋白质搭配使用
  高通量SNP筛选        
 
 
CRISPR/Cas9基因敲入用长单链DNA制备
· 制备长达5 kb的长单链DNA(ssDNA)供体模板
· 三步操作,简便快速
· 不存在随机整合或者表达,提高了基因编辑效率
· 单链DNA(ssDNA)供体模板对细胞的毒性要远低于双链DNA(dsDNA)模板
· 提示:包含NucleoSpin Gel 和 PCR Clean-up kit,用于基因编辑之前纯化strandase反应液
 
CRISPR/Cas9和其它基因编辑工具已经被成功应用于获得基因敲除突变(knockout),但众多事实证明在基因敲入上的应用有很大的难度。基因敲入所面临的主要难题是修复模板的制备和如何与Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物共导入至细胞。虽然单链DNA(ssDNA)修复模板展示出了优于双链DNA(dsDNA)模板的众多优势,但是其制备难度和制备费用都有很大的挑战性,因而限制了长单链DNA(long ssDNA)模板的应用。Guide-it Long ssDNA Strandase Kit可以很好地解决这个矛盾,可制备长达5 kb的ssDNA寡核苷酸,应用于CRISPR/Cas9或者其它基因编辑技术作为基因敲入实验修复模板。本试剂盒提供了一种简便的方法通过有选择地消化降解双链DNA PCR产物的正义链(sense strand)或者反义链(antisense strand),将其转化为单链DNA。该试剂盒提供了可以制备50条ssDNA链的足量试剂(25对正义链和反义链)。
 
■ 产品应用
· 制作knockin所需的ssDNA模板(>200 bp)
 
■ 操作流程概要
图1. 同源定向修复(Homology Directed Repair)实验用长单链DNA(long ssDNA)供体模板制备步骤示意图。第一步,通过合适的方法(克隆,融合PCR等)制作dsDNA起始模板,dsDNA模板包含与目的插入位点两侧同源的同源臂,模板中间是欲knockin的外源序列。第二步,通过在第一步中产生的dsDNA的不同位置上结合磷酸化的引物,制备出两种不同的dsDNA作为Strandase反应的底物。添加Strandase Mix A,开始消化降解正义链或反义链(Strandase Mix A有选择性地降解磷酸化的DNA链)。第三步,添加Strandase Mix B完成降解反应,从而获得ssDNA。最后,纯化ssDNA产物用于knockin实验。我们建议制备ssDNA正义链和ssDNA反义链并独立用于knockin实验。
 
■ 实验例
图2. 以双链DNA(dsDNA)模板为起始制备单链DNA(ssDNA)图A显示制备长ssDNA用于以AcGFP1标记GADPHTyr基因。从图中可以看出ssDNA相比较dsDNA,分子量更小。图B显示成功制备了作用于CCR5基因座的ssDNA,其长度范围为2-5 kb。
 
图3. 在HEK293细胞的GAPDH的C-末端定点敲入AcGFP1基因。本实验展示了使用ssDNA在细胞內源性蛋白中嵌入荧光蛋白质标签。所设计的HDR供体模板的同源臂序列为GAPDH外显子8的末端序列,AcGFP1与GAPDH处于同一阅读框(图A)。通过流式细胞术比较分析以dsDNA和ssDNA分别作为修复模板的实验结果(图B)。结果显示,当以dsDNA作为修复模板时,即使没有Cas9 RNPs,仍然出现相当多的带有绿色荧光的细胞克隆。当以长ssDNA正义链或者反义链作为修复模板时,只有同时加入Cas9和sgRNA,才会发生整合反应;而当没有Cas9 RNPs时,则没有检测到荧光背景,说明不发生整合反应。
 
图4. 检测插入位点是否有突变(细胞系为Cellartis human iPS cell line 18 (ChiPSC18))。ssDNA供体模板包含EF1-alpha启动子驱动的AcGFP1,两侧是与目的插入位点AAVS1同源的同源臂(600-bp)。突变操作后,分离出带有绿色荧光的克隆(GFP-positive),然后进行DNA测序检查目的插入位点的核酸序列。在所检测的细胞克隆中,目的插入位点左右两侧的核酸序列均正常,没有发现核酸突变。
 
图5. 比较knockin实验中导入dsDNA和ssDNA所产生的细胞毒性(细胞系为Cellartis hiPSC18)。插入序列为AcGFP1,其作用是用于标记tubulin。供体模板两侧带有长为350 bp的与目的插入位点同源的同源臂,总长度为1.5 kb。结果显示,即使在没有加入Cas9的时候,dsDNA的导入仍然可以引起显著的细胞毒性
 
■ 产品组份
Guide-it Long ssDNA Production System(Code No. 632644)
· Guide-it Long ssDNA Strandase Kit(Code No. 632645
PrimeSTAR Max Premix (2X) 625 μl × 4
Strandase Mix A 250 μl
Strandase A Buffer (10X) 250 μl
Strandase Mix B 50 μl
Strandase B Buffer (2X) 1.25 ml × 2
RNase Free Water 1 ml × 5
 
· NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up kit (Code No. 740609.50) 50次 × 2
 
■ 保存条件
Guide-it Long ssDNA Strandase Kit (Code No. 632645) -20℃
NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up (Code No. 740690.50) 室温
 
 
产品详情请点击:
 
 
■ 关联资料
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