| 常见问答 |
| Q-1: DNA测序样品用什么溶液溶解比较好? |
| A-1: 溶解DNA 测序样品时，用灭菌蒸馏水溶解最好。DNA的测序反应也是Taq 酶的聚合反应，需要一个理想的酶反应条件。如果DNA用缓冲液溶解后，在进行测序反应时，DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件，造成Taq 酶的聚合性能下降。 有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。的确，TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性，并且TE Buffer对DNA测序反应的影响也较小，但根据我们的经验，我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。 |
| Q-2: 提供DNA测序样品时，要注意哪些问题? |
| A-2: 一定要注意样品纯度和DNA量。如果客户提供的质粒浓度太低不能测序，我们就需要对质粒进行转化，此时需收取转化费。有些质粒提取法提取的DNA质量很好，象Takara、Qiagen、Promega的质粒制备试剂盒等。 提供的测序样品为PCR产物时。PCR产物必须进行切胶回收，否则无法得到良好的测序效果。 有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“测序样品的提供”部分的说明。 |
| Q-3: 测序结果有很多套峰 (出现很多N)，还照常收费，为什么? |
| A-3: DNA模板上出现二处以上的引物结合位点，或者DNA模板上有严重的重复序列，以及测序引物不纯时, 测序结果便会出现套峰现象。出现这种现象的原因由DNA模板本身或者引物 (限非Takara合成的引物) 本身所造成，对这些结果，公司会根据具体情况进行收费(详细见"测序结果说明")。 |
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| Q-4: 为什么用PCR产物测序时，经常会出现套峰现象? |
| A-4: PCR产物测序出现套峰现象，一般有以下几种原因： ◇ PCR用模板不纯或PCR用引物特异性不好，扩增出的产物除了目的片段外，还有与目的片段长度相近的片段，即使用凝胶电泳也无法分离开，这样的PCR产物测序结果是套峰。 ◇ 结构上的原因，造成了PCR产物测序出现套峰的现象。Poly A，Poly T以及原因不明的复杂结构的存在，都会出现测序结果套峰的情况，具体请看问答A-5。 ◇ 引物的非特异结合会造成杂峰干扰正常峰值，通常是引物不适合测序引起的，更换引物一般会解决。 |
| Q-5: 测序结果不到500 Bases，还照常收费了，为什么? |
| A-5: 如在DNA样品中的DNA序列分布匀称，没有复杂结构时，正常的测序反应能保证达到500 Bases以上。 但有一些DNA样品立体结构复杂，造成聚合酶延伸反应终止，测序信号突然减弱或消失，或者测序结果出现套峰现象。出现这些现象的原因由DNA模板本身所造成。 对这些结果，公司会根据具体测序情况，进行收费(详细见测序结果说明)。出现这些情况的原因分析如下： ◇ G/C rich、G/C Cluster。这种情况一般表现为测序信号突 然减弱或消失。 |
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| ◇ A、T的连续结构。这种情况一般表现为A、T连续结构后面的测序结果出现套峰。根据文献记载，原因在于聚合酶进行聚合反应时，由于A或T的连续，聚合酶难以识别完整的每个A或T，在某个A或T的后面便开始进行A或T连续结构以后序列的聚合反应(打滑现象)，造成测序结果紊乱，出现套峰。 一般在多少个A或T的后面能出现这种情况呢? 现在还没有这方面的报道。根据我们的经验，这一情况的出现和A或T的连续结构后面的序列的排列情况有着直接的关系。有时10多个A或T的连续结构后面便出现套峰，但有时60～70个A或T的连续结构后面的序列也一样可以完整地读出来。具体情况还有待考证。 一般来说，PCR片段直接测序时，A或T的连续结构后面的序列测序结果都会出现套峰。原因在于测序时经历了PCR反应及测序反应 (测序反应本身也是PCR反应) 二次聚合酶的打滑现象。 |
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| ◇ 原因不明的复杂结构，测序结果出现突然信号减弱或消失。从序列上看，DNA碱基排列并无特别异常。估计是DNA整体出现复杂结构，从某一位置开始聚合酶的聚合反应便无法进行。 |
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| Q-6: 为什么在测序结果上找不到测序引物的序列? |
| A-6: 目前使用的测序方法是在ddNTP上做荧光标记，测序仪通过检测ddNTP上的荧光来读取序列，因为引物本身是不做荧光标记的，所测序列是从引物3′ 末端后第一个碱基开始的，所以在测序结果上找不到测序引物的序列。如果是PCR产物，要想得到PCR引物的序列，可以将PCR产物进行双链测通或者将PCR产物克隆到载体上，用载体上的引物 (注意此引物也不能离插入片段太近) 测序。或是在已测得序列上反向设计并合成引物测出引物序列。 |
| Q-7: 在测序结果上，找不到测序用引物后面的序列，为什么? |
| A-7: 由于测序仪自身缺陷，紧接引物之后的测序结果信号较弱，一般在测序用引物后面几个至数十个 (严重时40-50个) 碱基会读不出来 (或者读错)，请引起注意。 |
| Q-8: 怎样使用Takara提供的测序结果? |
| A-8: 我们提供的是根据测序仪的自动分析，并经严格确认后的测序结果。但测序仪有时会发生误读或漏读现象，而我们的工作人员在检查时也没有发现，这时的结果会出现错误。只有原始的测序彩色波形图才是最正确的，请客户拿到结果后，进行详细确认。如有不明白的地方，请立即和我们联系，我们会随时确认并进行解决。 |
| Q-9: PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别? |
| A-9: 众所周知，PCR扩增过程中会出现很多错配现象，但不可能所有的错配都发生在同一位置。PCR片段直接测序时，其结果是PCR片段众多分子的混合物的结果。如果在某一个点上出现了几十次错配现象，但大多数分子 (或许是几十万个分子) 在这个点上应该还是正确的，在测序时，错配现象也就反映不出来了。因此，PCR片段直接测序的结果反映的是PCR用模板最原始的结果。而PCR片段经克隆后测序是测定了某一个分子的DNA序列。在几十个循环的PCR扩增过程中，很难保证某一个分子的任何点都不发生错配。因此，PCR片段经克隆后的测序结果，往往存在着一些错配的序列，和PCR片段直接测序的结果相比有些碱基会有所不同。这种错配现象的多少取决于PCR扩增时使用的DNA聚合酶的保真性能。要减少PCR扩增过程中的错配现象，在PCR反应时，请选用保真性能高的DNA聚合酶。 |
| Q-10: 测序结果和文献资料不一样，为什么? |
| A-10: 原因有很多，如同一种动物，在不同的种族之间，或者不同的个体之间，基因序列也不一定完全一样。如果是PCR产物克隆测序， 那还有PCR过程中的错配因素等等。我们提供的测序结果是客户样品序列的忠实结果，不能保证和文献序列完全一致，请理解。 |
| Q-11: DNA片段很长，一个反应读不到头，怎么办? |
| A-11: 如果DNA片段克隆在载体中，可以用载体上两端的引物同时测序，让其中间交叉互补，便可完全测通。如果这样还读不通，可根据已经测出的序列设计测序引物作进一步测序 (此称为Primer Walking法)，便可完全测通。 |
| Q-12: 测序完成后，测序样品和引物将如何处理 (或保存)? |
| A-12: ◇ 客户需要将测序样品或引物 (客户自带的) 返还时，测序结束后，我们会按客户要求寄回样品或引物 (客户自带的)。 ◇ 对于没返回的测序样品和引物，公司负责保存三个月(从样品收到之日算起)，超过三个月还需测序的样品，请客户另行提供。 |
| Q-13: 对于测序结果有疑问怎么办? |
| A-13: 请客户仔细阅读“测序结果说明”和“问答”的内容，如果还有疑问，请您在收到测序结果一个月之内与我们联系，我们会及时、认真给您检查测序结果，分析原因。 |
| Q-14: 怎样选择 (设计) 测序用引物? |
| A-14: 测序用引物要求非常严格，不同于PCR用引物。PCR用引物一般只要能和模板结合，3′ 端的几个碱基能完全配对，即使引物长达80～100多个碱基，只要调整PCR反应条件，也能成功进行PCR反应。 而测序用引物便不一样了，必须严格符合以下要求。本公司的测序用引物全用引物设计软件Oligo设计。在本公司测序时，我们可免费帮助设计测序用引物。 ◇ 长度在15～25个碱基左右，一般选择20个碱基(根据GC 含量作适当调整)，3′ 端尽量选择G或C碱基 (但不绝对)，以增加与模板的结合能力。 ◇ Tm温度应选择50℃-70℃左右(根据所用设计引物的软件不同，温度选择范围不同)。 ◇ GC含量应选择在50%左右，尽量避开A、T、G、C的连续结构。 ◇ 避开引物自身形成发夹结构或引物二聚体结构等复杂结构。 ◇ 保证引物和模板100%匹配，特别是3′ 端的几个碱基一定 要100%匹配。同时必须严格保证引物和模板之间只能有一个结合位点。 |
| Q-15: 怎样填写Takara DNA测序服务登记卡? |
| A-15: ◇ 如果您需要进行此项服务，请填写“Takara DNA测序服务登记卡”。填写后通过传真或E-mail发送给我们或当地代理商。 ◇ 仔细阅读“测序样品的提供”部分，具体填写测序样品的详细信息。填写示例参考如下。 |
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