| 合成常见问答 | |||||
| Q-1: 怎样对合成DNA/RNA制品进行定量? | |||||
| A-1: 由于核酸在260 nm附近有强吸收，因此常根据此性质，用紫外分光光度计测定核酸溶液在260 nm的吸光度值，据此对核酸进行定量，用OD值来表示。1 OD是指：置于光路长度为1 cm的比色皿中的DNA/RNA溶液，如果其在260 nm处的吸光度值为1，则称1 ml该溶液中溶解的DNA/RNA的量为1 OD。1个OD值的合成DNA/RNA的质量约为33 μg。 |
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| Q-2: 如何测定并计算OD值? | |||||
| A-2: 将DNA/RNA溶液进行适当稀释，使吸光度测定值与样品浓度的关系在直线范围内，再根据原溶液的总体积与稀释倍数计算该溶液的总OD值。例如，一个200 μl的DNA/RNA溶液，如果对其进行6倍稀释，测定值为1.0时，则该溶液的总OD值为：0.2 ml×6×1.0 OD/ml=1.2 OD 。 |
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| Q-3: 合成的DNA应如何保存? | |||||
| A-3: 1. 干燥制品很稳定，-20℃下保存2年没问题。 2. 溶解后的DNA也请保存于-20℃，最好是分份保存，避免反复冻融。 |
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| Q-4: 合成DNA溶液在室温下放置了数天，还可以使用吗? | |||||
| A-4: 溶液中的Oligo DNA在常温下放置3～4天应该没问题，但最好不要放置一个星期以上。其寿命与容器、溶剂的灭菌程度有关。 |
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| Q-5: 合成的RNA应如何保存? | |||||
| A-5: 1. 干燥制品如能存放于-80℃是最理想的，如不能请于-20℃保存，保存2年没问题。 2. 溶液状态的RNA最好保存在-80℃，如无条件，请保存于-20℃。 |
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| Q-6: 合成的荧光标记探针应如何保存? | |||||
| A-6: 1. 荧光探针必须避光保存。 2. 本公司做过几条探针的保存稳定性试验，干燥品-20℃保存2年未发现降解。作为本公司试剂盒中的组分，-20℃保存2年，探针功能正常。 |
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| Q-7: 制品溶解后发现有少许沉淀，会影响实验结果吗? | |||||
| A-7: 所有的制品纯化后都要进行脱盐，脱盐是使用C18柱进行的，偶而会有微量的树脂溢出而进入制品。树脂不影响任何反应结果，请稍许离心后取上清使用。 |
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| Q-8: 测定了制品的OD值后发现OD260/OD280<1.8，制品质量 (纯度) 合格吗? | |||||
| A-8: 由于核酸在260 nm附近有强吸收，而蛋白质在280 nm附近有强吸收，从生物体内提取核酸时，常用OD260/OD280比值来评价核酸纯度 (比值在1.8～2.0之间)，这一判断是基于序列中A、G、C、T所占比例大致相同时的结果。而合成的DNA/RNA则不同，序列很短 (通常在20～30个碱基之间)，其中A、G、C、T各种碱基所占比例很不相同，由于各种碱基的摩尔消光系数不同，因此不同碱基构成的合成DNA/RNA制品的OD260/OD280比值也不同，例如当序列中C、T碱基的含量高时，该比值会大大低于1.8。此外，序列中碱基的排列顺序也影响该比值。所以不能根据OD260/OD280比值来评价合成DNA/RNA制品的纯度。 |
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| Q-9: 能否根据电泳带的亮度对合成的DNA/RNA制品进行定量? | |||||
| A-9: 不能。因为EtBr是通过嵌入到核酸的双螺旋间而使其着色的。合成的DNA/RNA分子为单链，只有通过自身回折形成局部发夹环结构或链间形成部分双螺旋结构，才能被EtBr染色。由于不同制品的序列不同，形成双螺旋的能力不同，因此染色能力不尽相同，也就不能根据EtBr染色带的亮度来对合成的DNA/RNA进行定量。 |
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| Q-10: 使用3%的Agarose凝胶电泳合成Oligo DNA制品，发现有很多条泳带，为什么? | |||||
| A-10: Oligo DNA的电泳一定要使用变性PAGE电泳。Oligo DNA是单链DNA，容易形成复杂的立体结构，因此进行Agarose电泳时，容易出现多条泳带 (更无法用Agarose电泳进行定量了)。 |
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| Q-11: 进行PAGE电泳时，长度完全一样的Oligo DNA为什么泳带不在同一位置? | |||||
| A-11: 1. A、G、C、T的组成不同，电泳速度不同； 2. DNA的立体结构不同，电泳速度不同。 这种情况在Oligo DNA越短时越容易发生，长链Oligo DNA之间差别较小。 |
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| Q-12: PCR产物经克隆后测序发现，引物处的碱基有错误，为什么? | |||||
| A-12: 如果测序后引物处出现了问题，不排除PCR错配的可能，但更主要的原因应在合成引物本身。在引物合成过程中，除了人为将序列输错 (可核对合成报告单)，化学合成方法本身不可避免地会产生失败序列，具体分析如下： 1. 由于DNA合成是从3′ →5′ 端一个碱基一个碱基地连接上去的，每连接上一个碱基，都需要多步化学反应 (Detritylation、Coupling、Capping、Oxidation)，我们称之为一个循环。Coupling是上一个碱基的5′ OH 与下一个碱基的3′ 活性部分发生偶联反应，该反应的效率最高可达99%，即便如此，仍有1%的序列不能连接下一个碱基，这些序列在经过Capping后脱离循环，成为缺碱基的失败序列； 2. Capping是将没有连接上下一个碱基的5′ -OH乙酰化，阻止其进一步延伸。Capping的效率不可能达到100%，没有被Cap的5′ OH会进一步发生反应，造成中间缺碱基的失败序列； 3. Detritylation是将上一个碱基5′ OH上的保护基脱掉，准备连接下一个新碱基，脱保护的效率也很难达到100%，没有脱保护的5′OH会跳过该循环而直接进入下一个循环，造成中间缺碱基的失败序列； 4. 在Coupling步骤中，新碱基 (活性状态) 在没有与上一个碱基发生偶联反应前发生自身连接，造成多碱基的失败序列； 5. 合成时碱基G可能会转化成烯醇式异构体，PCR扩增时被DNA聚合酶识别作A，发生 G到A的转换。上述各种原因产生的失败序列可通过纯化不同程度地得到去除。对40 mer以下的DNA制品，HPLC是最好的纯化方法，其次是PAGE；而对40 mer以上的DNA制品PAGE纯化要优于单纯的HPLC纯化。所以，如您要对PCR产物克隆后测序，一定要选择PAGE纯化或HPLC纯化的引物。 |
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| Q-13: PCR产物经克隆后测序发现，引物处的碱基有错误，怎么办? | |||||
| A-13: 1. 因为引物纯度不可能是100%，因此，挑选克隆时，有可能挑选了杂质引物扩增出的PCR产物的克隆。此时，请重新挑选一个克隆测序，会得到正确的结果。 2. 如果挑选2～3个克隆测序情况还没改观，我们会免费重新合成引物。 |
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| Q-14: 进行蛋白表达实验数个月不成功，后经测序发现引物处有错误，怎么办? | |||||
| A-14: 1. 表达实验之前一定要对DNA序列进行验证。 2. 我们可以免费重新合成引物。 3. 如进行索赔时，按国际行业惯例，索赔范围限于制品价格范围之内。 |
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| Q-15: 怎样才能保证Oligo DNA的正确性? | |||||
| A-15: 1. 合成Oligo DNA时，选用高纯度级制品。 2. 避免使用过长的Oligo DNA，最好选用小于35 mer的合成DNA制品。 3. 进行克隆实验时，每次克隆都须进行测序验证，以保证序列的正确性，然后再进行进一步实验。进行蛋白表达实验时，尤其需要注意。 |
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| Q-16: Takara可合成多长的DNA，多长的RNA? | |||||
| A-16: Takara合成DNA的长度为2～150个碱基；合成RNA的长度为2～110个碱基。当合成的DNA序列较长时，由于合成及纯化方法的限制,很难保证制品中每个序列都正确无误。此外需要说明的是：如果待合成序列比较特殊 (例如多个“G”连续出现等)，合成收率相对较低，我们可能会根据具体情况加收费用；有时我们也可能无法合成订购的序列，此时本公司保留不接受订单的权利。 |
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| Q-17: 一般的合成Oligo DNA的5' 和3' 末端有磷酸基团吗? | |||||
| A-17: 没有，5' 和3' 末端均为-OH基。如需要加磷酸基团，订货时请特别注明，此时需收取磷酸化 (PO4修饰) 的费用。 |
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| Q-18: 平端的PCR产物难以克隆，为什么? | |||||
| A-18: 由于一般的PCR用引物的5′ 末端都没有磷酸基团，因此，扩增后的PCR产物的5′ 末端也没有磷酸基团。当克隆于去磷酸化的末端平滑载体时，无法克隆进去；而当克隆于非去磷酸化的末端平滑载体时，背景会极高。此时请对PCR产物的5′ 端进行磷酸化 (PO4修饰) 处理。 |
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| Q-19: 合成的引物进行PCR反应时无目的带，怎么办? | |||||
| A-19: PCR反应失败的原因很多，可以从以下几个方面考虑。 1. 引物和模板是否配对，同源性有多大? 2. 引物本身是否有立体结构，或者二条引物之间是否形成高次结构? 3. PCR反应用试剂是否能正常工作? 4. PCR仪是否工作正常? 5. PCR反应条件是否合适? 如果一切正常，还无法解决问题时，我们可以免费重新合成引物。如果重新合成的引物也无法解决问题时，请把引物和模板寄送给我们公司，我们可以帮助摸索PCR反应条件。 |
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| Q-20: 进行反义核酸实验时，是否要对DNA链全部进行S代修饰，除了S代外，还有什么办法可增加核酸在生物体内的稳定性? | |||||
| A-20: DNA经S代修饰后比较稳定，在细胞中不会被核酸酶降解。如果整条链全部S代，的确能增加DNA的稳定性，但会降低其Tm值，也即降低该反义DNA与靶序列的结合效率。因此，科研人员一般采用将DNA片段两端插入数个(通常3个)S代磷酯键(Phosphorothioated Bonds)，这样既能增加DNA的稳定性，又能增加反义DNA与靶序列的结合能力。不过如果要将反义DNA注入到活的动物体内，为增强稳定性，还是将整条链S代效果更好。 2' -OMe-RNA也阻抗核酸酶降解，可与S代DNA构成嵌合的反义核酸，这样既能增强反义核酸的稳定性，又能增加其与靶序列的亲和性 (2' -OMe-RNA与RNA的亲和力要比DNA与RNA的亲和力大很多)。 此外，5-Me-dC由于能增强DNA双螺旋的稳定性，有时也被掺入到S代的反义核酸中。 |
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| Q-21: FITC、6-FAM、5-FAM标记之间有何区别? | |||||
| A-21: 它们皆是荧光素标记 (Fluorescein)，三者结构间的区别如下： |
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| 从结构图可见，5-FAM与6-FAM互为异构体；而FITC则在与Oligo的连接方式上(硫脲键) 有别于前者(酰胺键)，但它们的发色团均为荧光素，通常使用中没有区别。 | |||||
| Q-22：淬灭基团为TAMRA或BHQ系列染料的双标记荧光探针在使用上有什么不同? | |||||
| A-22: 由淬灭基团TAMRA或BHQ系列染料组成的双标记荧光探针常常被用作水解探针（Hydrolysis Probes），用于Real Time PCR实验。由于这些淬灭染料的光谱学性质不同，作为淬灭基团使用时的特点也不同，现说明如下： |
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| 1. TAMRA为荧光染料，在淬灭报告基团的同时，自身会在更高波长处发射荧光，此发射荧光会对报告基团的检测造成影响，探针荧光本底（Background）相对较高。而BHQ系列为非荧光染料，淬灭报告基团，但自身不发射荧光，因此，探针荧光本底低，信噪比更大，检测灵敏度更高。 2. 淬灭基团对报告基团的淬灭有赖于二者的光谱迭盖（Overlapping），也即报告基团的荧光光谱应与淬灭基团的吸收光谱相交搭。对比TAMRA及BHQ系列染料的吸收光谱，可见TAMRA的吸收光谱覆盖范围窄，可与之匹配的报告基团种类比较少；组合使用的BHQ系列染料的吸收光谱覆盖范围则更广，从430 nm一直到近红外，可淬灭的报告基团种类更多（像Cyanine 3、Cyanine 5等的淬灭效果都很好）。因此可由BHQ系列染料组成一套双标记荧光探针用于多重PCR（Multiplexing PCR）。 |
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| Q-23: 双标记荧光探针设计时应遵循哪些原则? | |||||
| A-23: 1. 探针应位于两引物之间； 2. 探针中碱基G、C的含量应在20%～80%之间； 3. 避免同种碱基成串出现，特别是碱基“G”； 4. 碱基G不要出现在5' 末端； 5. 探针的TM值要比引物的TM值高8～10℃，应在68～70℃之间； 6. 探针长度超过30个碱基时，最好把淬灭基团放在中间，以防止荧光本底过高，这时探针的3'末端应加磷酸基封阻，以防探针在PCR反应过程中延伸。 |
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| Q-24: 何谓分子信标 (Molecular Probes)？与普通的双标记探针相比，在使用上有什么特殊性？ | |||||
| A-24: Molecular Probes是一类特殊的双标记探针，通常状态下，其两末端互补配对，形成茎-环结构 (发卡环结构)，发卡环结构迫使分别连在两末端的报告基团与淬灭基团紧密邻近 (此时检测不到荧光)，而一旦杂交到靶序列上，则报告基团与淬灭基团分开，Molecular Probes变得明亮起来，可检测到荧光。由于发卡环结构的存在，探针对靶序列检测的特异性增强，相对于普通的双标记探针，Molecular Probes对SNP有更强的识别能力，能区分序列上仅相差一个碱基的靶序列，因此Molecular Probes常用于SNP检测。此外，Molecular Probes也应用于活体细胞内的mRNA杂交、RNA加工、及转录过程的时时监测研究等。Molecular Probes的作用原理请参见下图： |
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| Q-25: 何谓Scorpion™ probes，该类型探针在应用上有什么特点？ | |||||
| A-25: Scorpions™ probes是具高灵敏度与特异性的双标记荧光探针和引物构成的杂合体，主要设计应用于定量PCR实验。下面是蝎型探针的作用原理图： |
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| Scorpions uni-probe的探针部分为单链双标记探针，其结构类似于Molecular Probes，两末端互补配对，形成茎-环结构 (发卡环结构)，发卡环结构迫使分别连在两末端的报告基团与淬灭基团紧密邻近，该双标记探针通过一个Blocker与PCR引物的5'端相连。Blocker阻止PCR引物的延伸；报告基团与淬灭基团的紧密邻近使探针中的报告基团不发荧光。 在定量PCR反应的起始循环中，PCR引物在Taq DNA聚合酶的作用下延伸，合成引物靶序列的互补链，当进入下一个循环时，发卡环打开，探针分子内杂交到新合成的靶序列上，此时，报告基团与淬灭基团分开，报告基团可发射荧光，检测到的荧光信号强度的增加与反应体系中靶序列的量成正比。 可设计成三种形式的Scorpions™ probe，一种是Scorpions uni-probe，采用发卡环形式；另一种是Scorpions bi-probe，采用双螺旋形式，还有一种是FRET形式的Scorpions™ probe。后两种Scorpions™ probe的作用原理这里不再详细介绍。不过，无论采用何种形式的Scorpions™ probe，其荧光信号的产生都是源于分子内杂交。分子内杂交反应快速有效，优先于任何可能与之竞争的副反应，因此使用Scorpions™ probe进行定量PCR检测的最大优点在于：可提供更强的荧光信号，更短的信号显示时间，同时与传统的双标记探针相比，具有更强的错配区分能力。Scorpions™ probe对SNP及突变检测更为理想。 |
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| Q-26: 如何对合成的Oligo DNA/RNA制品进行准确定量？ | |||||
| A-26: 核酸定量普遍采用的方法是紫外分光光度法：测定核酸溶液在260 nm的光吸收，样品溶液吸收光的量(吸光度)正比于溶液中溶质的量。吸光度与溶液中核酸浓度间的转换关系依据Lambert-Beer定律： A=ε260 C L 其中： A: 吸光度(OD) ε260 : 溶液中核酸在260 nm的摩尔消光系数(单位，L/mol.cm) C: 溶液浓度(单位，mol/L) L: 光路长度(单位，cm) 应用Lambert-Beer定律对核酸进行定量时，必须保证测定值在核酸浓度与吸光度值呈直线关系的范围内，否则计算结果与实际浓度之间会出现偏差。 普通的分光光度计 (待测溶液装在样品池中)，测定样品溶液浓度准确的直线范围通常是吸光度值在0.1～1.0之间，如果待测样品溶液浓度过大，必须进行适当稀释，以保证测定值小于1.0。同样，待测样品溶液的浓度也不能太低，如果测定值小于0.1，测定准确度会降低(测定值重复性降低)。 NanoDrop等微体积测定仪的测定原理也是紫外分光光度法，因为使用该类仪器所需样品溶液体积小，也即光路较短(1 mm或更短)，因此吸光度与样品浓度间呈直线关系的范围加大。但对NanoDrop1000，测定数据准确的范围是2～100 ng/μl,这个准确测定范围对于单链DNA，相当于吸光度值在0.06～3之间，对于双链DNA，相当于吸光度值在 0.04～2之间。因为低浓度测定对待测溶液要求会很高，溶液中不能有任何微小颗粒，否则测定结果会偏高，因此，应用NanoDrop 1000对单链DNA进行定量时，要想获得准确的测定结果，根据我们的经验，通常最低吸光度值高于0.2比较好，也即吸光度测定值在0.2～3之间。 近些年，针对低浓度的双链DNA定量发展了荧光定量技术。因为尽管紫外分光光度法是普遍采用的核酸定量法，但此方法也存在一定缺点：紫外吸收测定没有选择性，不能区分DNA、RNA和蛋白质，测定结果也容易受其它污染物 (dNTPs、盐、有机化合物)的影响，在有前述干扰物存在时，不能对核酸进行准确定量；此外，紫外分光光度法定量核酸的灵敏度也不够高。荧光定量技术可特异地定量低浓度溶液中的双链DNA，而不受溶液中存在的RNA、蛋白质等污染物的影响。例如，利用Invitrogen的Qubit测定仪，结合应用Quant-iT dsDNA HS assay试剂盒，可对浓度低至10 pg/μl的双链DNA进行定量。对低浓度核酸溶液定量，Qubit的定量准确度要远远高于NanoDrop 1000。当然，Qubit测定仪也可特异地定量单链DNA、RNA或蛋白质，不过需要强调的是，对溶液中单链DNA定量时，应该选用与双链DNA不同的荧光定量试剂盒。 对常规浓度范围内 (吸光度测定值在0.2～1.0之间) 的合成Oligo DNA/RNA定量，Qubit的测定结果应该与紫外吸收法的测定结果一致 (不同仪器之间测定结果可能会存在系统误差)。 我们提供的合成Oligo DNA/RNA制品有两种干燥方式：真空干燥或冰冻干燥，无论您收到的是哪种方式干燥的制品，溶解样品前，都需要将Tube管进行短暂离心，使样品离心至Tube管底部，再进行后续的溶解、稀释、测定等操作，这样既可保证不损失样品，同时也可保证测定结果的准确性。 |
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| Q-27：长度小于15 mer 的Oligo DNA/RNA如何溶解？ | |||||
| A-27: Oligo DNA/RNA长度≤15 mer或序列特殊的情况下，溶解性会降低（Milli-Q水可能会不溶），建议使用TE (pH7.5-8.0) 溶解。 |
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| Q-28：Takara提供的巯基Oligo制品是二硫键形式的吗？ | |||||
| A-28: 由于自身原因，处于游离态的巯基（SH-R）在运输或者保存过程中会发生自发氧化，生成二倍体，通常需要在使用前进行还原。 为了保证产品质量，方便客户获得更佳的使用效果，Takara提供氧化形式存在的巯基修饰Oligos，即二硫键（S-S），巯基处于被保护状态。使用前需进行还原。以5’巯基为例，还原前后的示意图如下： |
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| 通常使用TCEP或者DTT作为还原剂，TCEP本身不带电荷，且不含巯基，通常无需从Oligo溶液中去除，即可进行后续实验。 另外，客户如有需要，Takara可以随货提供还原剂TCEP，请提交订单时备注说明。 |
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页面更新：2020-04-26 10:35:14
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