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技术服务信息

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测序样品的提供

■ 质粒DNA的测序
◇ Sample形态为提纯质粒时
请注明载体名称及结构情况、插入片段的长度及插入片段的酶切位点等情况,请提供1 μg以上提纯的质粒DNA (浓度大于50 ng/μl)。如果提供质粒偏少需要我公司转化制备时,收取质粒转化制备费用。
 
■ PCR产物直接测序
◇ Sample形态为纯化后的PCR产物时
请提供切胶回收纯化后的PCR产物500 ng以上 (浓度大于25 ng/μl),并请提供浓度 (浓度须正确) 大于3.2 pmol/μl的测序引物 20 μl以上。此外,请注明PCR产物的长度、引物的具体序列等情况。
◇ Sample形态为未纯化的PCR产物时
请提供1-5 μg的未纯化PCR产物, 我们负责纯化测序 (另收取纯化费)。同时请提供浓度 (浓度须正确) 大于3.2 pmol/μl的测序引物 20 μl以上, 并请注明PCR产物的长度、引物的具体序列等情况。
◇ Sample形态为PCR模板DNA时
请提供适量的模板DNA及用于PCR扩增的引物 (浓度大于3.2 pmol/μl约100 μl)。我公司负责PCR反应和PCR产物的纯化及测序 (需收取PCR反应费及PCR产物的纯化费) 。此外,请注明PCR产物的长度及引物的具体序列等情况。
◇ 注意事项
1. PCR产物直接测序成功的关键是PCR产物的纯度,所以我公司提倡切胶回收PCR产物。如果有几条PCR产物长度相近,用电泳胶也无法分开,此时的PCR产物便无法直接测序。这种情况建议把PCR产物克隆后测序。
2. PCR产物直接测序成功的另一要因是引物,不是能做PCR反应的引物便能测序。测序用引物要求较高,引物的3' 端必须与模板完全匹配,含有Mix碱基的引物一般不能测序 (特别是3' 端)。此外,测序引物长度一般为20个碱基左右,GC含量必须在 50-60%左右。而且,用于测序的引物一定要纯,纯度必须大于90%。
3. 在PCR扩增时,难以扩增 (扩增后的PCR带较弱) 的PCR产物在测序时一般成功率较低。
4. 小于150 bp的PCR产物直接测序效果不好,请克隆后测序。
 
■ Cosmid、Fosmid中插入DNA片段的测序
请提供纯化后的DNA大于5 μg (因每个测序反应的用量需500 ng以上)。DNA必须注明浓度,并请提供浓度 (浓度须正确) 大于5 pmol/μl的引物10 μl以上。
 
■ 预混合样品测序
将测序样品和引物按照要求的浓度和量,事先混合好,取12 μl指定浓度的DNA模板和3 μl的引物(浓度为5 pmol/μl)混合(若使用公司的通用引物,只需要按照所要求的浓度提供12 μl的DNA模板就可以)。样品和引物混合方法,请参考下表:
DNA类型 模板大小 浓度
(ng/μl)
模板总量
(12 μl)
引物浓度 引物总摩尔数
(3 μl)
混合后的体积
(模板+引物)
已纯化PCR产物 ﹤ 500 bp 3 ng/μl 36 ng 5 pmol/μl 15 pmol 15 μl
501 ~ 1,000 bp 4 ng/μl 48 ng
1,001 ~ 2,000 bp 6 ng/μl 72 ng
2,001 ~ 3,000 bp 12.5 ng/μl 150 ng
3,001 ~ 5,000 bp 20 ng/μl 240 ng
﹥ 5,001 bp 同质粒 同质粒
质粒 ﹤ 5 kb 25 ng/μl 300 ng 5 pmol/μl 15 pmol 15 μl
5 ~ 10 kb 50 ng/μl 600 ng
﹥ 10 kb 75 ng/μl 900 ng