我们使用cookie改善您的浏览体验并提供有意义的内容。请阅读我们的cookie协议
收藏我们 在线订购

产品选择指南

技术服务信息

机构用户解决方案

当前位置:首页> 产品选择指南 > cDNA合成 & 克隆 > TA克隆和平滑末端克隆 > TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit
TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit
品牌 Code No. 产品名称 包装量 价格(元) 说明书 数量
Takara RR015 TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit 10 次 ¥1,109
 
■ 制品内容 (10 次量,50 μl PCR)
Sau3A I Cassette(200 ng/μl) 25 μl
EcoR I Cassette(20 ng/μl) 25 μl
Hind III Cassette(20 ng/μl) 25 μl
Pst I Cassette(20 ng/μl) 25 μl
Sal I Cassette(20 ng/μl) 25 μl
Xba I cassette(20 ng/μl) 25 μl
Cassette Primer C1(10 pmol/μl) 20 μl
Cassette Primer C2(10 pmol/μl) 20 μl
Ligation Solution I* 150 μl
Ligation Solution II* 75 μl
TaKaRa LA Taq(5 U/μl) 10 μl
10×LA PCR Buffer II (Mg2+Plus) 100 μl
dNTP Mixture (各2.5 mM) 160 μl
Control DNA Fragment (100 ng/μl) 25 μl
Control Specific Primer CS-1 (10 pmol/μl) 10 μl
Control Specific Primer CS-2 (10 pmol/μl) 10 μl
   
*:Ligation Solution I和II与DNA Ligation Kit Ver.2.1 (Code No.: 6022) 中的组份相同。
 
 
■ 制品说明
本试剂盒利用PCR法,使用TaKaRa LA Taq、Cassette以及Cassette Primer,可特异性地扩增cDNA或基因组上的未知区域。通过应用LA PCR技术,提高了保真性能,减少了克隆时变异点的导入。使用本试剂盒,不必经过繁杂的文库构建及筛选等,就能简单地得到基因组等上的长链目的DNA。
 
■ 保存
-20℃。
 
■ 原理
本试剂盒原理的具体步聚如下:
1. 用适当的限制酶将待克隆的Target DNA完全分解。
2. 与具有对应的限制酶酶切位点的Cassette进行连接反应。
3. 用Cassette Primer (Primer C1) 和根据已知区域的DNA序列设计的Primer (Primer S1),进行第1次PCR (1st PCR) 反应。
4. 使用内侧Primer (Primer C2和Primer S2) 进行第2次PCR (2nd PCR) 反应,特异性地扩增目的DNA片段。
图1. 特异性PCR扩增原理图
具体原理见图1。因为在设计上,Cassette的5’末端没有磷酸基,所以Target DNA的3’末端和Cassette的5’末端的连接部位形成缺口。在第一次PCR反应的第一个循环时,从Primer C1开始的延伸反应在连接部位终止,限制了Primer C1和Primer C1同一引物之间的扩增,从而控制了非特异性PCR扩增。只有从Primer S1开始延伸合成的DNA链,才能成为Primer C1的模板,进行DNA的特异性扩增反应。再用内侧Primer (Primer C2,Primer S2) 进一步进行第二次PCR反应,可以高效特异性地扩增目的DNA。 当蛋白质的氨基酸序列已知时,可以根据已知信息设计Mixed primer代替Primer S1, S2,扩增编码蛋白质的cDNA。
 
注意事项
1. 37℃室温溶解完全后,用枪头搅拌或上下摇晃microtube使试剂混合均匀。避免剧烈振荡。有时当混合10× LA PCR Buffer 和TaKaRa LA Taq时,小心混匀,避免产生气泡或使酶失活。使用前试剂放置在冰上。
2. 反应前用移液器轻微吸打混匀反应液。不要剧烈振荡。
3. 退火及延伸条件:45-68℃范围内以2℃间隔实验确定最适退火温度。在3 step PCR中,延伸速度为72℃ 1 min./kb。退火-延伸在68℃进行 (2 step PCR)*,同样建议1 min./kb。当温度低于68℃时,需更长时间。
*:由于TaKaRa LA Taq在60-68℃范围内显示出很强活性,可进行Shuttle PCR (Two step PCR)。
 
 

浏览此产品的客户还对以下信息感兴趣