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T细胞治疗研究解决方案
 
使用转基因T细胞(T淋巴细胞)来靶向治疗癌症是一种很有前景的方法,特别是对于难以使用传统方法来治疗的癌症。最为常见的两种方法围绕着在基因工程T细胞中引入新的T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)(Humphries 2013)来开展。
过继性T细胞疗法的工作流程主要包括以下几大步:从病人体内分离T细胞,在体外对这些T细胞进行基因改造,然后将改造后的T细胞回输至病人体内。除了这种被称作自体同源的方法之外,全世界的一些公司正致力于开发一种可以从单一供体生产,然后用于治疗数千名患者(异体同源方法)的治疗方法。在这两种方法中,T细胞改造都是在患者体外进行的(体外基因治疗)。在T细胞改造方面,Takara可以为您提供较为完善的解决方案,助力T细胞治疗研究
 
 
 
1. TCR/scFv调取:SMARTer RACE 5’/3’ Kit
 
SMARTer RACE 5’/3’Kit使用SMARTer技术进行RACE (Rapid amplification of cDNA ends),无需接头连接即可合成cDNA。所合成的cDNA可直接用于5’ RACE PCR或者3’ RACE PCR,因此抗体可变区等可通过简便的操作流程来进行克隆。该方法已在T细胞治疗中有所应用,并且在T细胞/B细胞相关研究中的使用频率也越来越高。
 
· Dossa RG., et al. (2018) Development of T-cell immunotherapy for hematopoietic stem cell
   transplantation recipients at risk of leukemia relapse. Blood. 131(1):108-120.
· Arai Y., et al. (2018) Myeloid Conditioning with c-kit-Targeted CAR-T Cells Enables Donor Stem
   Cell Engraftment. Mol Ther. 26(5):1181-1197.
· Su S., et al. (2017) Blocking the recruitment of naive CD4+ T cells reverses immunosuppression
   in breast cancer. Cell Res. 27(4):461-482.
· Benjamin Y. Jin, et al. (2018) Engineered T cells targeting E7 mediate regression of human
   papillomavirus cancers in a murine model. JCI Insight. 2018 Apr 19; 3(8): e99488.
 
2. CAR/TCR载体构建:In-Fusion HD Cloning Plus
 
In-Fusion HD Cloning Plus技术通过加速抗原及CAR载体的构建,加速了T细胞基因改造流程。In-Fusion HD克隆:快速 (15 min), 高效(克隆效率>95%), 无序列依赖 (任何PCR插入片段都可以克隆到任意载体的任意位点), 无缝(靶标抗体不会加入任何额外碱基对或者氨基酸), 定向, 高通量(HTP)。
由于高克隆效率和高准确度,多项研究中使用In-Fusion HD 克隆技术进行抗体片段高通量克隆(Spidel et al. 2016; Chen et al. 2014; Meng et al. 2015)。
 
· Yi Z., et al. (2018) Optimizing EphA2-CAR T Cells for the Adoptive Immunotherapy of Glioma.
   Mol Ther Methods Clin Dev. 2018 Feb 2;9:70-80.
· Hale M., et al. (2017) Homology-Directed Recombination for Enhanced Engineering of Chimeric
   Antigen Receptor T Cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 2017 Jan 10;4:192-203.
· Shum T., et al. (2017) Constitutive Signaling from an Engineered IL7 Receptor Promotes Durable
   Tumor Elimination by Tumor-Redirected T Cells. Cancer Discov. 2017 Nov;7(11):1238-1247.
· Tashiro H., et al. (2017) Treatment of Acute Myeloid Leukemia with T Cells Expressing Chimeric
   Antigen Receptors Directed to C-type Lectin-like Molecule 1. Mol Ther. 2017 Sep 6;25(9):2202
   -2213.
 
 
3. 慢病毒成功转导:Lenti-X Titration and Concentrator kits
 
目前有多种载体用于TCR-T/CAR-T细胞制备,已开展的临床试验以病毒载体转导的方式为主,而以非病毒载体转导的方式也逐渐受到青睐。
合适的病毒滴度是慢病毒成功转导的关键因素。Lenti-X Titration kits可提供p24 ELISA、qRT-PCR和GoStix三种慢病毒滴度测定方法,耗时仅需4小时-10分钟,更为快速高效,轻松加速T细胞制备;Lenti-X Concentrator可轻松浓缩慢病毒滴度,不需要特殊设备。
 
4. 增强慢病毒转导T细胞:GMP Grade RetroNectin
 
在过继性T细胞疗法中,为了有效地将TCR / CAR基因引入T淋巴细胞中,高转导效率是至关重要的。RetroNectin GMP级试剂可用于增强病毒转导和扩增幼稚T细胞群,该产品已在全球44个机构中用于超过68种基因治疗临床试验方案。
美国国立卫生研究院Steven Rosenberg博士研究组、纪念斯隆凯特琳癌症中心、日本三重大学医院在进行相关疾病临床研究过程中,都使用了RetroNectin GMP级试剂进行了T细胞转导,众多其它临床研究使用文章也已发表。
 
5. CRISPR/Cas9基因编辑:Guide-it Gene editing products
 
CRISPR/Cas9基因组编辑是其中一种非病毒载体转导方式,在癌症免疫治疗中已展示出了令人乐观的结果,可用于破坏癌症细胞免疫逃逸机制。Kagoya et al., 2018报道抑制DOT1L可减轻异体T细胞反应。在这篇文章中作者使用Guide-it sgRNA In Vitro Transcription KitGuide-it Recombinant Cas9制备了Cas9-sgRNA核糖核蛋白(RNP)复合物,通过电转RNP复合物的方式,敲除了CAR-T细胞中的若干内源性TCRs,其敲除效率可达到~30%。
 
另外,Nature杂志发表了一项开创性研究,Roth et al.,2018描述了一种高效的T细胞基因改造方法,通过将Cas9-sgRNA RNP复合物与双链DNA或单链DNA HDR模板(使用了Guide-it Long ssDNA Production System制备单链DNA)共电转,不仅可规避病毒传递,而且可最大限度地减少细胞毒性。
 
 
用户讲座: 如何选择合适的HDR模板 点击查看>>
主讲人:Theo Roth,MD/PhD student at UCSF
 
 
6. T细胞受体NGS分析:SMARTer immune profiling kits
 
免疫基因组学应用于癌症研究的一个挑战就是在癌症患者接受免疫治疗之前和之后,确定T细胞库并鉴定肿瘤反应性T细胞克隆 (Liu et al. 2017)。SMARTer immune profiling kits利用SMART技术和基于5'-RACE的方法来捕获TCR转录本完整V(D)J可变区,提供批量细胞、单细胞及高通量单细胞等多种T细胞受体(TCR)的NGS分析解决方案。
 
· SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit
   以总RNA或纯化后细胞为起始进行分析。
· SMARTer Human scTCR a/b Profiling Kit
   可以完全捕获TCR-α和TCR-β可变区,
   确定单个T细胞内TCR α/β链配对信息。
· SMARTer ICELL8 human TCR a/b profiling
   可在高通量单细胞平台SMARTer ICELL8 cx
   系统上轻松捕获TCR转录本完整V(D)J可变区。
 
 
 
 
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