| qPCR技术介绍（二）——RNA提取&反转录 |
| 一般进行定量PCR的目的，是为了进行mRNA的表达量分析，或者对RNA拷贝数进行定量，或者确定RNA病毒是否存在的定性分析，那么首先都需要进行反转录实验，将RNA反转录为cDNA。 本文为您介绍反转录实验相关的一些基础概念。 |
| 制备RNA的关键，一是要抑制细胞中的RNA分解酶，二是要防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。 在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用 RNA 操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。 |
| 【使用器具】尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前进行干热灭菌（180℃，60 min）或使用DEPC水处理再高压灭菌。 RNA实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其它实验。 |
| 【试剂配制】用于RNA实验的试剂，需使用RNA实验用的一次性塑料容器盛装，或使用上面方法处理过的玻璃容器盛装。使用的无菌水需用0.1%的DEPC处理后进行高温高压灭菌。RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。 |
| RNA的纯度会影响cDNA的合成量，所以在提取RNA后需要进行RNA纯度和质量检测。 |
| 260 nm、320 nm、230 nm、280 nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。 OD260/OD280（R）体现了RNA中的蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的RNA的R值应在1.8～2.0之间。当R< 1.8时，溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显；当R>2.2时，说明RNA已经被水解成了单核苷酸。 在对核酸进行吸光度检测时，需要注意稀释液应使用TE Buffer。 |
根据OD260，可以计算提取的RNA浓度：
RNA浓度(μg/μL）= (A260-A320）×稀释倍数×0.04 |
利用1%的琼脂糖凝胶（含溴乙锭）电泳结果，对提取的Total RNA进行RNA完整性以及是否有基因组DNA污染的评价。
如果可以清晰观察到两条rRNA条带（真核生物：28S和18S；原核生物：23S和16S），且其浓度比值大约为2:1，则RNA未降解。 若观察到smear现象，则RNA已发生降解。 如果观察到大于28S或23S的条带，则样品可能有基因组DNA污染，这时可以考虑使用DNase I处理。  |
| 本方法基于微流体技术，仅需要2-7 ng RNA用于分析，可以替代传统的基于凝胶的分析方法。通过RNA Integrity Number (RIN)评估RNA样品的完整性。除了评价RNA质量外，这个自动化系统还可以很好地提供RNA浓度的估计值。 |
| 进行Two Step RT-PCR反应时的反转录Primer，可使用Random Primer、Oligo dT Primer或Gene Specific Primer三种引物，它们与RNA模板互补结合的位置关系如图所示，我们必须根据实验目的区分使用。 |
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| 通常基因表达解析，Random Primer最适合。Random Primer能够在mRNA全长范围内进行高效率反转录，所以目的片段在mRNA的任何位置都能很好地进行表达解析。 |
| 想从Poly (A) 尾开始反转录反应时，使用Oligo dT Primer。但是如果目的片段距离Poly (A) 尾过远，反转录效率将会降低。从Poly (A) 尾至目的片段扩增位置之间存在强二级结构或mRNA有分解可能的时候，使用Oligo dT Primer要特别注意。 |
| 进行One Step RT-PCR反应时，反转录引物只能使用基因特异性下游引物，而不能使用Random Primer和Oligo dT Primer。 利用Real Time RT-PCR进行基因表达解析时，将Random Primer和Oligo dT Primer混合使用效果更佳，不仅可以在mRNA全长范围内高效率反转录，还可以将mRNA二级结构及mRNA分解的影响控制在最小限度。 |
| 提取的Total RNA中常常混有基因组DNA，而基因组DNA可以直接作为PCR模板进行扩增，造成解析结果不准确。 为了避免这种情况发生，我们可以采取两种措施：① 引物设计时避免基因组DNA扩增；② 使用DNase I 处理除去基因组DNA。 |
| 引物设计时避免基因组DNA扩增 |
| 首先确认目的基因的基因组结构，选择跨越较长的内含子。然后，在这个内含子两侧的外显子上分别设计上、下游引物。 Real Time PCR反应时通常扩增的目的DNA片段长度都比较短，设置的条件也是适合短片段DNA的扩增，超过500 bp就很难扩增了。所以，当内含子足够长时，基因组DNA来源的扩增就不能发生。 |
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| 当内含子较短时，可将其中一条引物设计在exon junction上，这样，基因组DNA来源的扩增也不能发生。但是，此种方法不适合具有单个外显子的基因、或者不具有内含子的生物种以及基因组情报没被解析的生物种等。 |
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| 使用DNase I 处理除去基因组DNA |
| 使用常规方法提取Total RNA后，再使用DNase I 分解混入的基因组DNA，最后进行苯酚/氯仿抽提、乙醇沉淀等纯化Total RNA。或者使用能去除基因组DNA的反转录试剂进行反转录反应。Takara明星产品PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) （Code No. RR047）是可以除去基因组DNA的定量PCR专用反转录试剂，试剂盒中附带gDNA Eraser，仅需42℃、2分钟即可高效去除基因组DNA。 |
页面更新：2023-03-30 16:31:20
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