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应用SMART® 技术快速克隆抗体可变区
 
SMARTer RACE cDNA Amplification
· 合成含有可变区全长序列的cDNA片段
· 轻松准确地克隆和分析多种抗体基因
· 改进RACE PCR实验,更容易操作,无需连接酶克隆
 
升级的全长cDNA合成方法
    单克隆抗体已经被广泛地应用于各种科学研究和诊断,而确切的抗原特异性是研究的关键点。另外,由于抗体工程(如嵌合抗体和人源抗体的发展)的进步,抗体生产技术的发展,将单克隆抗体直接应用于治疗的可行性越来越高。
    由于抗原抗体特异性取决于抗体可变区的特异结构,分析可变区的序列是很多应用中的第一步,包括无动物系统的抗体生产,抗体作为药物的研究,以及工程化抗体类似物的生产等。利用SMART cDNA合成技术和精简的流程,SMARTer RACE kits提供了一个快速、简便地分析这些重要的变化序列的方法。
 
可变区序列分析的解决方案
    免疫系统可以生产1亿种抗体来对抗外界入侵物质。 抗体的这种多样性通过淋巴细胞发育中V(D)J的重组而形成。抗体分子包含重链和轻链,重链和轻链又分别包含可变区和保守区,V(D)J 重组是可变区与其他基因序列几乎随机的重新组合。这个过程会生成特异的抗原受体。由于可变区位于重链和轻链的N端,且决定了抗原抗体的亲和性,分析这段区域非常重要。
 
Figure 1. Basic antibody structure.
 
    分析可变区时,设计一个通用引物来扩增所有的抗体序列是异常困难的。重链和轻链5’端的天然可变性决定了序列同源性很低。一个有效的分析这些可变区域的方法是在可变区下游的保守区设计简并引物。后续可以使用5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)方法克隆这段目的区域,之后再进行测序。使用SMARTer RACE kits具有足够的灵敏度,可以获得全部5’端的信息。
 
SMARTer技术在RACE应用中的优势
    使用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒,在反转录过程中将SMARTer II A寡核苷酸添加到cDNA的末端。该过程结合了Clontech特别的SMART(RNA模板5'末端的转换机制)技术,允许反转录酶达到转录本的5'末端。大多数其他RACE PCR方法都没有捕获5'端,因此错过了重要信息。此外,在5'末端添加SMART序列使得该位点能够用于下游扩增和克隆。 SMARTer RACE组分和流程的优化大大减少了非特异性背景并提高了扩增效率。即使样品被基因组DNA污染,强大的系统也能获得可靠的结果,适用于广泛的应用。用高保真聚合酶扩增cDNA片段确保了有效分析所需的核苷酸序列的准确复制。
 
小鼠杂交瘤来源抗体基因的快速克隆
    在克隆小鼠杂交瘤抗体基因之前,首先根据NCBI核酸数据库注册的小鼠lgG的序列,设计了针对H链, L (κ)链, 或L (λ)链的反转录引物(RT primer)以及RACE PCR所需的反向引物(5' RACE primer)。通过SMARTer RACE方法从total RNA合成了第一链cDNA后,直接进行5'-RACE PCR,这样不仅可以获得5’端序列,还可以获得带有可变区全部序列的cDNA片段。
 
Figure 2. Experimental workflow for 5′-RACE PCR of the antibody variable domain using the SMARTer RACE cDNA Amplification Kit.
 
    培养并确认小鼠杂交瘤细胞分泌由γ2a型重链和κ型轻链组成的单克隆抗体。提取total RNA,按照说明书protocol进行第一链cDNA合成和5'-RACE PCR,取一部分PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳确认。
 
Figure 3. Confirmation of successful amplification of antibody genes from mouse hybridomas.
 
    克隆扩增产物至pUC118后测序。确认序列包含单克隆抗体H链和L链N端氨基酸序列对应的ORF。
    我们对其他六种杂交瘤细胞系的抗体可变区进行同样的基因序列分析。获得了所有抗体亚类的PCR产物。分析序列后显示,90%的H链克隆和50%的L链克隆序列准确编码目标抗体蛋白质N端氨基酸序列。
    某些实验中,得到的克隆与目标抗体具有序列同源性,但由于其序列中存在终止密码子,因此不能编码功能性抗体的ORF。另外,我们怀疑一个特定的克隆含有用于细胞融合的骨髓瘤细胞的转录物,因为该序列是从多个杂交瘤中获得的。
    与编码靶单克隆抗体的序列相比,一些杂交瘤产生了具有该共同序列的更多克隆。基于这些结果,显然应该将靶抗体的N-末端氨基酸序列的分析和确认与DNA序列分析平行进行。
 
Figure 4. Amplification of various subclasses of mouse antibody genes.
 
SMARTer RACE cDNA的进一步改良,更简化的克隆流程
    为了优化RACE流程,我们对SMARTer RACE Kit做了重大更新。上述数据是通过联合使用SMARTer RACE cDNA Amplification Kit,PrimeSTAR® HS DNA Polymerase用于PCR,Mighty Cloning Reagent Set (Blunt End) 用于连接和克隆。
    之后对产品升级,得到的SMARTer RACE 5'/3' Kit (Code No. 634858, 634859),具有同样的SMARTer核心技术,并在反应条件和下游克隆方面进行了进一步的改良。 新试剂盒包含了SMARTer RACE实验所需的所有组分(除了基因特异性引物外)。 通过将SMARTer II A寡核苷酸与SMARTScribe 反转录酶配对,获得高灵敏度和特异性以及低背景的结果。
    SeqAmp DNA聚合酶提供了强大的PCR性能,在扩增长或富含GC的挑战性靶序列时尤其有效。
    SMARTer RACE 5'/ 3'试剂盒的组成部分之一是In-Fusion® HD Cloning Kit,它可以在不使用连接酶的情况下轻松、准确地克隆5'-RACE片段。该试剂盒中还提供了与In-Fusion技术兼容的线性化载体,并且试剂盒中所包含的引物专门设计用于匹配该载体。 In-Fusion克隆方法非常高效,非常适合所有克隆应用。通过将这项技术与成熟的SMARTer RACE方法配合,从RNA到克隆只需要两天时间就可以进行分析。
 
结论
    SMARTer RACE cDNA合成为抗体可变结构域的全长序列分析提供了灵敏、简化的解决方案。这些可变区的多样性虽然对有效免疫应答至关重要,但对于希望分析这些基因片段以进行广泛研究(包括药物开发)的研究人员来说,这是一项挑战。
    获得该序列后,使设计具有更好的体内稳定性、改善的亲和力或双重特异性的抗体成为可能。抗体可变区的评估是这些研究和许多其他抗体修饰的第一步,SMARTer 5'-RACE PCR是用于克隆这些靶序列进行测序的有效方法。
 
 
 
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SMARTer RACE 5'/3' Kit