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NGS用PCR酶如何选择,优质文献为您解惑
 
下一代测序技术 (NGS) 的兴起对生命科学产生了深远的影响,目前已经被广泛应用于不同物种的科学研究中。PCR扩增是许多NGS文库构建的必要步骤。尽管许多PCR酶可以用来高效、准确、特异性地扩增单一靶标,但很少有PCR酶能够应对“NGS PCR”带来的挑战,即无偏差扩增不同大小和不同GC含量的靶标。
 
 
2024年4月,英国剑桥大学医学院Wellcome Sanger研究所在《Microbial Genomics》期刊上发表了一篇名为《Identifying the best PCR enzyme for library amplification in NGS》的文章。文章中研究人员评测了市场上在售的20余种PCR酶,用于NGS文库构建,为短读长和长读长的NGS筛选出最适合的PCR聚合酶。
测评结论:
TaKaRa Ex Premier™ DNA Polymerase(Code No.RR370)是短读长NGS文库扩增的优选酶之一
Terra™ PCR Direct Polymerase Mix(Code No.639270)是长读长NGS文库扩增的优选酶之一
 
接下来我们一起了解一下本篇文章的主要内容。
 
为什么要谨慎选择用于NGS文库扩增的PCR酶?
研究结果表明,在测序前,不同PCR酶在扩增效率和均一性上存在明显差异。进一步证实了PCR可能是引入基因组数据中偏差的来源。所以PCR酶的选择对于NGS文库扩增至关重要,特别是GC含量不均匀的模板,更加容易出现覆盖率偏差。
1. 收量评价——降低循环圈数,降低偏差
被评价的PCR酶之间,其产量有比较大的差异。当使用低扩增效率的PCR酶时可能会带来较低的产量,反应过程则需要更多的PCR循环,结果的偏差会更突出。
使用TaKaRa Ex Premier扩增1 ng模板,进行 14个PCR循环后,结果的覆盖均一性与500 ng模板的PCR-Free文库的覆盖均一性接近,即使在GC含量比较极端的模板中也是如此。
值得注意的是本研究中测试的基因组之一,是疟原虫基因组(AT含量接近100%),因为感染者大多是年幼的儿童,只能采集到较少的血液样本,因此通常只能获得少量的DNA样本。利用TaKaRa Ex Premier,仅1 ng模板,就可以获得非常均匀的基因组覆盖
2. 低覆盖率指数评价——PCR酶的综合扩增能力
研究人员评价了不同PCR酶的低覆盖率指数(Low Coverage Index,LCI)。
LCI越低,说明NGS结果的覆盖率越高,测序深度越高。
有些PCR酶在特定基因组中表现较好,但TaKaRa Ex Premier在测评的所有基因组中,均表现了高覆盖率和良好的覆盖率均匀度。包括测试的百日咳杆菌、大肠杆菌、艰难梭菌、恶性疟原虫基因组以及人类基因组。
与PCR-Free方法构建的文库覆盖率相比,TaKaRa Ex Premier等三种PCR酶的偏差最小,覆盖率均匀度与PCR-Free方法构建的文库接近
3. 扩增准确性评价——PCR酶对SNP和indel的检测灵敏度
将NGS测序结果与参考基因组序列和突变序列列表进行比较,评价每个PCR酶的扩增准确性。
被评价的20余种PCR酶在微生物参考基因组中,SNP和indel检测灵敏度最高的是TaKaRa Ex Premier等三种PCR酶。
TaKaRa Ex Premie以非常高的重现性复制了很多SNP和 indel位点,SNP检测灵敏度达到了99.17%,indel检测灵敏度达到了93.85%。
4. 人类基因组扩增评价——对庞大模板的扩增能力
人类基因组测序,特别是用于学术和临床结果的变异发现,是NGS的主要应用之一。人类基因组比微生物基因组要大得多,也更加复杂。TaKaRa Ex Premie的测试结果表现出色,覆盖范围均匀 (低LCI),SNP和Indel检测灵敏度都比较高,优于被评价的大多数PCR酶。。
在本研究中,研究人员还筛选出 Terra™ PCR Direct Polymerase Mix为长读长NGS文库构建的优选酶之一。
 
另外,除了上述推荐的PCR酶外,Takara还有多款适用于NGS扩增的PCR酶产品供您选择! 例如在2014年,暨南大学和美国南加州大学的研究人员曾经在Scientific Reports(Nature)期刊上发表了一篇名为《Long-range PCR in next-generation sequencing: comparison of six enzymes and evaluation on the MiSeq sequencer》的文章。文章中研究人员使用6种应用于长片段扩增的PCR酶,分别扩增12.9 kb、9.7 kb和5.8 kb的目的片段。结果发现只有PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase可以在相同的 PCR 反应条件下扩增出三个长度不同的靶标,而其余5种PCR酶均需要调整PCR反应条件才能够扩增出三个靶标,并且PrimeSTAR® GXL的性价比也较高。因此研究人员最终选择了PrimeSTAR® GXL进行后续的NGS实验。
在后续实验中,研究人员使用PrimeSTAR® GXL扩增了9名受试者的样本基因组并进行测序。最终发现,在相同的PCR反应条件下,PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase可以扩增绝大部分具有不同大小和Tm值的扩增子。这也再次证明Takara PCR酶在NGS领域具有出色的性能。
 
在未来,Takara Bio将持之以恒地运用生命科学领域的专业知识,不断创新,为科研工作者提供高质量、高性能的产品,共同开启生命科学研究的新篇章!
 
TaKaRa Ex Premier™ DNA Polymerase
√ 对于粗提样品、GC/AT rich、长链(~30 kb)等难扩增模板均可顺利扩增,具备高成功率
√ α型酶具有良好的校正功能,能保持高保真性
√ 预混型试剂,并且在-20℃保存不冻结,可节省操作时间
√ 另有添加色素试剂的版本,可视性好,可直接进行电泳,操作更简便(RR371A/B)。
详细产品信息及实验例请点击链接查看:TaKaRa Ex Premier™ DNA Polymerase
 
Terra™ PCR Direct Polymerase Mix
√ 高度敏感的DNA聚合酶,可直接使用动物或植物组织、粗提裂解液进行扩增
√ 对于难以扩增的模板(如GC含量大于70%)也能进行很好的扩增
√ 预混型试剂,639285试剂盒中还包括提取buffer和Loading Dye等
详细产品信息及实验例请点击链接查看:Terra™ PCR Direct Polymerase Mix
 
PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase
√ 对于人类基因组DNA能够进行30 kb左右的长链扩增
√ 可对应GC rich,AT rich及高模板量,是一款兼具高通用性的高保真酶
√ 另有优化用于高速PCR扩增的2X预混型试剂,加入了色素,可直接电泳(R052A/B)。
详细产品信息及实验例请点击链接查看:PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase
 
【推荐用于NGS的PCR酶一览表】
产品名称 Code No. 包装量 不同NGS应用类型推荐
 TaKaRa Ex Premier™ DNA Polymerase  RR370A/B  200/800 Rxns  短读长NGS文库扩增
 Terra™ PCR Direct Polymerase Mix  639270/71  200/800 Rxns  长读长NGS文库扩增
 PrimeSTAR® GXL DNA Polymerase  R050A/B  250/1000 U  长链扩增子测序
 PrimeSTAR® Max DNA Polymerase  R045A/B  100/400 Rxns  高保真扩增子测序
 Multiplex PCR Assay Kit Ver.2  RR062A/B  100/400 Rxns  207重Multiplex PCR for NGS
 Tks Gflex™ DNA Polymerase  R060A/B  250/1000 U  NGS文库扩增;长链扩增子测序
 MightyAmp™ DNA Polymerase Ver.2  R071A/B  250/1000 U  16S菌群解析;单细胞RNA测序
 
 

页面更新:2024-07-08 13:30:57