| Takara逆转录病毒基因导入系统解决方案 |
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逆转录病毒是一种单链RNA病毒，能够将基因导入至多数处于增殖期的细胞中，由于导入基因可整合到染色体中，因此可以实现长期稳定的基因表达。重组逆转录病毒制备相对容易，但仍然需要在P2级实验室条件下操作。逆转录病毒载体是基于莫罗尼小鼠白血病病毒（MoMLV）开发的，在基因治疗方面有着丰富的应用实绩，也已被广泛应用于肿瘤和干细胞研究。
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逆转录病毒表达载体
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| 野生型莫罗尼小鼠白血病病毒（MMLV）基因组约8.2 kb（包括两个LTR）。人工构建一个大于8.2 kb的基因组，同样也会导致产生不稳定的病毒粒子和病毒滴度的下降。与慢病毒表达载体相类似，大部分病毒基因组已被其他有用的序列（如筛选标记或荧光蛋白基因）取代，但仍有足够的空间用于克隆转基因。由于不同逆转录病毒表达载体包含的有用序列不同，因此用于克隆转基因的可用空间也不同。 |
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逆转录病毒包装制备
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与慢病毒相似，重组逆转录病毒也会有产生RCL的可能性，所以逆转录病毒包装质粒也会进行特别设计。病毒包装用质粒上插入有逆转录病毒的结构基因，gag-pol和env基因，这两种基因是逆转录病毒构建和复制所必需的基因，但是质粒上缺少包装信号Ψ序列和LTR序列，因此包装用质粒本身是无法包装成逆转录病毒的，只有将其和包含Ψ序列和LTR序列的逆转录病毒表达载体共转染到293或者293T包装细胞中，才能包装得到逆转录病毒，产生具有自我复制能力逆转录病毒的几率也非常低。
为方便使用，可以构建gag和pol基因稳定表达细胞系，作为逆转录病毒包装细胞。这样将含有env基因的表达质粒和克隆了目标基因的表达载体共转染包装细胞，就可以制备出重组逆转录病毒了。这样的包装细胞系，有助于降低转染难度，提高成功率。
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逆转录病毒一般实验流程
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| 以Takara稳定表达gag和pol基因的GP2-293包装细胞为例 |
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Takara Retro-X™ 逆转录病毒基因导入系统可以提供从载体、包装系统到病毒滴度测定、病毒浓缩和整合位点分析试剂盒一整套逆转录病毒基因导入产品。
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| 这款通用型包装系统是非常优质的一款逆转录病毒包装系统，病毒包装使用GP2-293包装细胞系。常用的四种包膜，包括VSV-G、eco、ampho和10A1，分别由四种不同的载体单独提供，可以根据目标细胞选择最适合的包膜。包膜载体与逆转录病毒表达载体共转染GP2-293包装细胞系，转染后48小时可以获得高滴度的兼嗜性、单嗜性、双嗜性或泛嗜性病毒粒子。 |
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| 下图为使用表达红色荧光蛋白DsRed2逆转录病毒载体和相对应的一种包膜载体共转染GP2-293细胞，四种包膜载体均由Retro-X通用型包装系统(图A-D)提供。转染GP2-293细胞48小时后，取10 μl病毒液感染NIH 3T3细胞。48小时后，通过流式细胞术检测病毒滴度。蓝色区域表示阳性细胞，紫色线表示阴性对照细胞。不同包膜类型都可以获得理想的病毒滴度。
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Retro-X qRT-PCR Titration Kit提供了一种快速简便的逆转录病毒滴度测定方法。这款试剂盒使用qRT-PCR和TB Green技术，在对逆转录病毒基因组拷贝数定量之前使用了RNA快速纯化步骤。这个方法中引入的RNA纯化和DNase I处理过程对该方案是至关重要的，因此即使是使用瞬时转染包装的病毒（总是含有残留的质粒DNA），也可以使用该试剂盒准确定量 。这种滴度检测方法，检测时间只需要4小时，并且适用于所有基于MMLV的逆转录病毒载体(不包括MSCV)。相较于需要长达10天才能完成的传统滴度测定方法，大大缩短了病毒收获和目标细胞感染之间的时间间隔。
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经验证这款试剂盒具有广泛的动态范围。使用这款试剂盒对109-104个拷贝的Retro-X RNA对照模板进行qRT-PCR检测，从扩增结果图来看，在无模板空白对照(NTC)低背景情况下，显示了至少6个数量级的动态范围(图A)。图A的滴定标准曲线显示Ct和RNA拷贝数（对数坐标）之间存在很强的线性相关性，R2=1.000，PCR效率为107.4%(图B)。
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| Retro-X Concentrator是一款可以快速、简单和高效地浓缩任何逆转录病毒的浓缩试剂，基于MMLV或MSCV的逆转录病毒上清液均适用。这款浓缩试剂使用简便，只需将逆转录病毒上清液与浓缩试剂按照建议比例混合，孵育一段时间后，使用标准离心机对混合物进行离心和收集。使用这款浓缩试剂，不需要超速离心操作，可将逆转录病毒滴度提升至高100倍， 并获得非常好的回收率。 |
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| 这种病毒浓缩方法远比超速离心法要简单的多。与超速离心法相比较，这款浓缩试剂使用起来要比超速离心更灵活、更易于使用。Retro-X Concentrator是一种4X浓缩液，因此它可以对任何体积的含有任何病毒量或任何起始滴度的病毒上清液进行浓缩。 |
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| Retro-X Integration Site Analysis Kit是一款整合位点分析试剂盒，可以鉴定重组逆转录病毒载体在宿主细胞基因组中的整合位点。通过逆转录病毒的复制生命周期，逆转录病毒RNA基因组的DNA拷贝会随机整合到宿主基因组中。所选择的整合位点对转基因的表达和宿主细胞的表型都会有重要影响。这款试剂盒使用GenomeWalker技术来识别整合位点，通过对其进行测序和比对分析，可以获知相对应的染色体整合位点。 |
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| Takara的受体增强技术可用于临时提高任何想要感染的靶细胞表面的病毒受体蛋白密度，让原本由于受体密度低而对病毒感染具有抵抗力的细胞变得能够被有效感染。Ecotropic Receptor Booster可以让原本只能感染啮齿动物细胞的单嗜性逆转录病毒，能够有效感染人类细胞。如下图所示，单嗜性逆转录病毒或者慢病毒通常不能有效感染Jurkat细胞、人间充质干细胞或人原代神经祖细胞。然而，使用Ecotropic Receptor Booster预处理这些类型的细胞后，这些细胞就能被有效转导。 |
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除此以外，还可以提供丰富多样的γ-逆转录病毒载体和逆转录病毒载体套装，包括组成型表达载体，专为高病毒滴度和高转基因表达水平而设计；四环素诱导表达载体（Tet-One系统），实现尽可能严谨地控制基因表达；MSCV表达载体，可以在多能细胞系中包括小鼠或人类造血细胞、胚胎干细胞(ES)和胚胎癌(EC)细胞，导入和表达靶基因；以及带有荧光蛋白基因的载体，可以用作亚细胞定位或标签研究，或者报告基因相关研究。 |
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以为这就是全部吗？当然不是，点击链接了解更多>>重组逆转录病毒(Retrovirus)制品。 |
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Takara Bio作为重要的生物技术企业，在病毒基因导入系统方面造诣颇深、体系完备，拥有慢病毒系统、逆转录病毒系统、腺相关病毒系统、腺病毒全套解决方案，为相关生物学基础研究提供强力支持，为寄予厚望的细胞与基因治疗研究护航加码。
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