| 谁懂啊～ Takara这款试剂盒“一盒两用”，快进来看！ |
| 很多“宝粉们”想问：基因敲入后那么多的样品，如何初步鉴定是否发生了基因片段敲入或SNP突变呢？别急！Takara为您提供Guide-it™ Knockin Screening Kit（Code No. 632659/ 632660）试剂盒，可以帮您初步筛选样品是否通过基因敲入产生了基因编辑。 |
| Guide-it™ Knockin Screening Kit试剂盒的应用场景 |
| 基因编辑技术最强大的应用之一是能够在感兴趣的基因组位点引入精确的突变。然而，这个编辑结果发生的可能性通常很低，因为它通常依赖于一种称为同源定向修复（HDR）的内源性修复机制，该机制以相对较低的频率发生。因此，在两个不同的阶段，检测成功的HDR事件至关重要。第一阶段涉及优化实验条件，以在编辑的群体中实现最高百分比的无错误HDR事件，然后再继续分离单细胞克隆。第二阶段涉及鉴定在96孔板中进行单细胞分离和扩增后携带目标编辑的细胞系。Guide-it Knockin Screening Kit试剂盒提供了一种简单的基于荧光的方法，可用于筛选编辑的群体以及来自96孔板的克隆，用于从SNP替换到更长插入的编辑，从而满足了在两个阶段灵敏检测成功HDR的需求。 |
| Guide-it™ Knockin Screening Kit试剂盒优势多多！ |
| ♦ 大大节省时间和精力，整个操作流程只需大约4个小时。 ♦ 操作简便，主要包括基因组靶标位点PCR扩增，绿色和红色双色荧光检测的酶法测定。 ♦ 采用基于荧光的检测方法，不论所敲入的插入物长度（从单碱基替换到更长的插入片段）或被编辑的基因组区域序列如何，都可以对基因敲入所产生的基因组编辑位点进行检测。 ♦ 不需特殊仪器，使用荧光读板机或定量PCR仪检测荧光信号即可进行测定。 |
| 那么，为什么说这款试剂盒有两种作用呢？下面我们一起来看看吧！ 在进行基因敲入后，可以产生长片段基因敲入的编辑结果，也可以产生SNP突变的编辑结果。针对不同的结果，Guide-it™ Knockin Screening Kit有着不同的用途。 |
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| 图一 |
| 如图一：基因编辑后，通过FACS或有限稀释法分离的大量细胞群和克隆细胞系可能表现出多种模式，例如野生型（WT），引入插入/缺失（indel）或敲入了全长插入片段。从克隆细胞中提取DNA并扩增靶标位点，然后将PCR产物与两套不同的displacement oligo（紫色）和flap probe进行杂交：一个与插入片段的5'端杂交（Flap-probe oligo A; 绿色），另外一个与3'端杂交（Flap-probe oligo B; 红色）。当displacement oligo和flap probe完全与扩增的靶标位点杂交时，此时的displacement oligo和flap probe之间无gap，Guide-it Flapase会剪切flap probes从而产生相应的荧光。如果同源重组成功并且全长插入片段无缝正确插入的情况下，探针会与两端完全杂交，Guide-it Flapase剪切flap probes后产生绿色和红色荧光信号。当仅检测到一种荧光信号（红色或绿色）时，表明插入片段分别在5'端或3'端发生了缺失。如果没有检测到荧光，则表明靶标位点依然是野生型序列或者引入了indel。 |
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| 图二 |
如图二：在二倍体细胞中进行编辑时，每个等位基因的编辑结果可能会有所不同，从而产生多种可能的组合。如果没有发生基因编辑，细胞仍然可以保持纯合型（Wild type）；如果发生了不准确的NHEJ修复，会有一个或两个等位基因被修饰（Indel）；如果发生了成功的HDR，则可以获得一个或两个等位基因中引入了目标SNP的细胞（Successful HDR）。 |
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| 图三 |
| 如图三：演示了如何鉴定是否发生了G>A单碱基替换，以及是否为含有两个不同等位基因的杂合克隆，其中G是野生型碱基，被编辑为A。在基因编辑后，将单细胞扩培成为克隆细胞系，目标基因的靶标位点可能具有几种不同的基因型结果。扩增靶位点后，将PCR产物与不同的寡核苷酸探针进行杂交：displacement oligo（紫色）与flap-probe oligo A（绿色；编码SNP等位基因，A）或flap-probe oligo B（红色；编码WT等位基因，G）组合使用。寡核苷酸退火至PCR产物后，Guide-it Flapase酶（剪刀所示）识别完全的碱基配对，并切割flap-probe oligo 5’端部分。切割下来的flaps由相对应的Guide-it flap detectors检测，并分别产生绿色或红色荧光信号。在图三的示例中，在靶标位点仅产生红色信号的克隆细胞系分析是纯合WT（G/G），而同时产生红色和绿色信号的则是携带已编辑和WT等位基因（G/A）的杂合克隆。 |
接下来我们一起来看下用户反馈吧！ |
| “The kit was very good at identifying WT/SNV hets, which is often what I'm looking to uncover.” —Dr. Justin McDonough, THE JACKSON LABORATORY |
| “The assay was easy and fairly quick to perform...Sanger sequencing was complicated to analyze since one allele was edited and the other allele had an indel resulting in mixed electropherograms...I like the fact that the fluorescent probes are built into the kit and the user only needs to supply fairly standard probes which are not very expensive." —Dr. Karin Nitiss, UNIVERSITY OF ILLINOIS AT CHICAGO |
页面更新：2023-07-17 12:54:13
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