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Takara腺相关病毒基因导入系统解决方案 |
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基因治疗将使医学领域发生革命,为治疗常见和罕见遗传性疾病带来了新希望。在基因治疗这场竞技赛中,腺相关病毒(AAV)载体已经迅速成为体内基因导入主要平台之一。
AAV已经在多个遗传性眼科疾病治疗临床试验中显现出有明显的治疗效果,而且不会引起显著的不良免疫反应。AAV也是一种广泛应用于癌症基因治疗的病毒载体。多种AAV载体已被用于肿瘤治疗,众多临床前研究结果显示,AAV基因治疗成功抑制肿瘤生长,致使肿瘤消退。另外,AAV还广泛应用于血液病、代谢类等疾病的治疗研究,展现出了广阔的应用前景。
由于AAV免疫原性和细胞毒性低,能够转导非分裂细胞,并且整合到宿主基因组中的频率非常低,因此被众多研究学者认为安全性更高。经过重组和改造的AAV拥有不同的血清型,根据血清型不同而具有不同的宿主范围和病毒特征,可以有效作用于特定细胞类型,包括分裂和非分裂细胞类型。使用者需要根据靶标细胞或者组织类型选择适合的血清型。目前使用频率较高的血清型为AAV2,其它血清型也逐渐被广泛使用。
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AAV基因组是约4.7 kb的单链线状DNA分子,在两端都有被称为反向末端重复序列(ITR)的发夹结构。ITR的功能在于基因组复制起始位点及辅助病毒粒子包装。AAV基因组包含了3个开放阅读框:Rep编码参与复制和转录的蛋白质;Cap编码病毒衣壳蛋白质;AAP编码用于病毒粒子形成的非结构蛋白质。Rep区域编码4种不同的蛋白质(Rep78, Rep68, Rep52和Rep40,Cap区域编码3种不同的蛋白质(VP1, VP2 和 VP3 )。
一般来说,AAV只有在辅助病毒(如腺病毒或疱疹病毒)存在下才能复制。目前,AAV的包装制备大多使用无辅助病毒包装系统,也就是在不使用辅助病毒的情况下制备重组AAV。AAV的制备也是通过将编码重组AAV所需因子的质粒转染HEK 293细胞来完成的。制备AAV载体一般需要以下3种质粒:含有目的基因表达框和2个ITR的质粒,包含AAV2 Rep基因和各种血清型Cap基因的质粒,包含腺病毒E2A、E4、VA基因的质粒。
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从表达、包装、提取到纯化和滴度测定,一站式购齐,省心无忧。 |
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★ 无辅助病毒AAV载体制备系统 |
AAV Helper Free System是一种特别的可制备高滴度AAV的无辅助病毒系统,可提供AAV 1型 (AAV1) 、2型 (AAV2) 、5型 (AAV5) 、6型 (AAV6) 制备系统。我们在该系统的包装载体中引入了一种可提高病毒滴度的人源miRNA(hsa-miR-342),与一般只表达Rep基因和Cap基因的pRC2 Vector相比,病毒滴度可提高2倍。由于AAV是一种微小病毒,可克隆的目的基因片段大小限制在不超过2.5 kb。 |
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★ 强强联合的AAV-CRISPR系统 |
AAV与CRISPR/Cas9基因编辑技术结合使用,可以通过AAV载体导入CRISPR/Cas9进行基因治疗,可以让更多无望治疗的疾病变成有望治愈。在AAV-CRISPR 系统方面,可以提供酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)两种不同来源Cas9的系统:携带酿脓链球菌来源的Cas9(SpCas9)的双载体系统和携带金黄色葡萄球菌来源的Cas9(SaCas9)的单载体系统。SaCas9与SpCas9不同,SaCas9所识别的PAM序列为NNGRR(T),N表示任意碱基,R表示A或者G,T具有较强的偏好性。 |
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★ 扩大AAV载体产量必备单品 |
AAV2倾向于保留在制备细胞中(由于肝素结合域的原因),可以使用专用的提取试剂AAVpro Extraction Solution从制备细胞中提取并回收病毒粒子。而其他血清型AAV,更容易释放到培养液中,因此从培养液中分离AAV可以有效扩大AAV载体产量。AAVpro Concentrator就是可以从细胞培养上清液中分离浓缩任何血清型AAV载体这样一种简便高效的方法。与仅涉及AAV粒子沉淀的其他浓缩方法相比,AAVpro Concentrator操作过程中包含了过滤步骤,可以产生更高纯度的AAV载体。 |
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★ 通用简便的AAV载体纯化方式 |
AAV载体作为体内基因导入的主要平台之一,使用高纯度的病毒粒子是很有必要的。即便是将基因导入至培养细胞时,使用纯化后的AAV粒子也可以消除杂质所带来的影响。AAV粒子的纯化通常使用CsCl密度梯度超速离心法或碘克沙醇超速离心法,但这两种方法不仅需要熟练的操作手法,同时还存在耗时长和回收率低等问题。Takara通用型AAVpro Purification Kit不受血清型限制,可以从AAV粒子制备细胞中纯化出AAV粒子:特别的AAV粒子提取方法,省去了冻融和超声破碎等繁琐操作;特别的AAV载体纯化方法,通过简单的操作即可有效去除杂质。 |
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★ 通用快速的AAV滴度测定方法 |
Takara基于qPCR技术开发了通过测定AAV基因组来测定AAV滴度的试剂盒,同以往的DNA印迹法和ELISA法相比,可以更准确、更快速地(2.5小时以内)获得实验结果。AAVpro Titration Kit(for Real Time PCR)Ver.2试剂盒中的引物特异针对AAV载体的公共区域AAV2反向末端重复序列(ITR)而设计,如果载体的ITR区域来自AAV2(实际上常用的AAV载体也正是这样的情况),那么无论您制备出的AAV病毒是哪种血清型(取决于病毒包装时所使用的Cap基因),都可以使用这个试剂盒测定病毒滴度。如果不确定该试剂盒是否适用,请与我们的技术服务部门联系,并提供您的载体序列。 |
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Takara Bio作为重要的生物技术企业,在病毒基因导入系统方面造诣颇深、体系完备,拥有慢病毒系统、逆转录病毒系统、腺相关病毒系统、腺病毒全套解决方案,为相关生物学基础研究提供强力支持,为寄予厚望的细胞与基因治疗研究护航加码。 |
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