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Takara：自动化！高通量！单细胞人TCR分析
 
背景小知识：
 
· TCR
T淋巴细胞（T cells）是负责适应性免疫应答的主要细胞，其抗原识别功能主要依赖于T细胞受体（T cell receptor, TCR）,TCR是由两条不同的肽链构成的异二聚体，主要是α链和β链。TCR由基因组DNA上几个不同区域转录翻译而来，其中的V区，D区，J区会发生重排产生不同的受体链，也就是产生多样性的T细细胞受体，以应对不同的抗原类型，因此分析TCR多样性主要就是分析V(D)J区片段的序列特征。
T细胞受体库的多样性保证了个体在多变的环境中能对外来抗原（病原体）产生有效的免疫应答，保护人体健康。
 
T细胞受体组成 示意图
 
· 单细胞的TCR分析有什么意义呢？
对于T细胞的发育过程来说，针对细胞群体测序，只能提供单个TCR链的频率信息，却不能与细胞进行一一配对，而通过单细胞测序的方式能够进行更为细致的研究。同时，在对特定免疫反应的研究中，通过单细胞TCR测序分析，可以减少群体细胞间异质性信息的干扰。
我们知道一种TCR受体往往在一种类型的免疫反应中发挥作用。因此，对单个T细胞的TCR测序分析有助于了解特异的α-β受体链组合配对信息，进一步掌握抗原-受体的特异性识别关系，对免疫疗法中的抗体设计有很大的帮助，继而解释免疫应答机制、免疫耐受原因、免疫调节形式等相关生命现象！
 
· 单细胞的TCR分析有什么意义呢？
对于T细胞的发育过程来说，针对细胞群体测序，只能提供单个TCR链的频率信息，却不能与细胞进行一一配对，而通过单细胞测序的方式能够进行更为细致的研究。同时，在对特定免疫反应的研究中，通过单细胞TCR测序分析，可以减少群体细胞间异质性信息的干扰。
我们知道一种TCR受体往往在一种类型的免疫反应中发挥作用。因此，对单个T细胞的TCR测序分析有助于了解特异的α-β受体链组合配对信息，进一步掌握抗原-受体的特异性识别关系，对免疫疗法中的抗体设计有很大的帮助，继而解释免疫应答机制、免疫耐受原因、免疫调节形式等相关生命现象！
 
· TCR-Seq存在的问题与困难：
※ 常规细胞群体免疫组库测序只能提供单个TCR链的频率信息，不能与细胞进行一一配对。无法获得TCRα和β链的配对信息及全长V(D)J序列
※ 单细胞TCR的建库方式成本昂贵，与针对大批量免疫细胞的建库方式相比，这种方法覆盖到的细胞数量有限。
因此，单细胞的建库方法变得越来越重要，只有这种方法才可以在细胞水平上非常准确地鉴定TCR链配对信息，从而使得分析达到更高的复杂水平，同时也可以更加真实地反应生物体内的功能。在此基础上，降低单细胞TCR建库成本，提高通量也是TCR-Seq亟待解决的难题！
下面我们来了解一下Takara的高通量低成本TCR建库方案吧！
 
Takara“自动化高通量”TCR免疫组库解决方案，了解一下！
ICELL8® Human TCR a/b Profiling Reagent Kit & ICELL8 cx Single-Cell System
该建库方案整合了SMART(Switching Mechanism at 5’End of RNA Template)和基于5’RACE的免疫组库NGS文库制备技术，该技术能明显降低PCR偏差，确保实验结果反映出的是样本的真实情况，在高on-target率的基础上，能有效降低测序成本！
为实现“自动化高通量”建库，搭配使用Takara旗下的ICELL8 cx Single-Cell System高通量自动化单细胞分选平台。
ICELL8 cx Single-Cell System纳升级高通量自动化单细胞分析平台（点击获取产品手册）
 
ICELL8 cx平台可在15 min内在微孔芯片上分选得到上千个“活的单细胞”，搭配使用ICELL8® Human TCR a/b Profiling Reagent Kit可从上千个单细胞中捕获TCR转录本的完整V(D)J可变区，产生的文库可同时提供α链和β链的多样性信息。
该方法在微孔芯片中完成单细胞分选，以及cDNA第一链合成。SMART-Seq Indexed Oligo已经预先固定在芯片的微孔中。这样，同一个细胞来源的转录本cDNA可以方便、正确地佩戴上相同的“身份标签”。接下来，将转录本cDNA从芯片收集至离心管内，进行V(D)J区序列特异性扩增、测序接头连接，即得到用于上机测序的单细胞TCR免疫组库。
Takara高通量TCR免疫组库解决方案，同时支持5’末端差异表达分析!
 
· 高通量地阐明单细胞中T细胞受体α-β链多样性
※ 灵敏性更高：基于RACE技术保证低丰度TCR变体的检出
※ 特异性更强：获得全长reads，目的reads占比高，更正确的配对信息
※ 5’端捕获测序差异表达分析：通过比对5’末端信息，产生所有转录本差异表达数据
※ 灵活、高通量的单细胞分析：单次实验同时分析8个样品，生成上千单细胞的测序数据
 
· 性能展示
※ 实验材料：T细胞和PBMCs（外周血单个核细胞）
※ 实验内容：单细胞分选及后续单细胞TCR克隆型分析， 从芯片中收集cDNA后，使用3’TCRα/β 基因特异性（GSP）引物进行特异性扩增，后续对纯化后的文库使用Miseq测序仪进行测序，双端2×300 bp reads，600 cycles。下机数据可以通过配套的ICELL8 scTCR Analyzer软件进行拆分，进一步分析结果。
* 分选与文库构建操作参照实验手册标准流程进行
 
① T细胞和PBMC的克隆型reads计数结果：
阴性对照：包含除样本外的所有反应成分
阳性对照：Jurkat总RNA建立阳性对照
阈值：8 reads
Negative control ：15个，Positive control ：15个
T cells ：530个，PBMCs ：590个
 
箱线图展示了不同细胞中的TCRα（蓝色）和TCRβ（红色）的克隆型读数，可以看出ICELL8® Human TCR a/b Profiling Reagent Kit在不同细胞中的克隆型的检测能力发挥稳定，让您对测序结果信心更足！
 
② α-β链配对分析
Cell type # of wells or cells # of cells with clonotype calls % of cells with clonotype calls
Neg control 15 0 0%
Pos control 15 15 100%
PBMC 590 261 44%
T cell 530 399 75%
由于PBMC不仅仅只由T细胞构成，约44%的PBMC细胞检测到了TCRα/β的转录本，其中α-β链配对比例占70%。75%的T细胞包含TCRα/β的转录本信息，α-β链配对比例占70%。另外，除了α-β的配对之外还观察到β-β(β)、α-α(αα）、αα-β(ααβ)和其他非标准组合。
 
③ TCRβ转录本的克隆型分析
弦图展示了TCRβ在PBMC和T细胞中的克隆多样性及分布信息，对两种细胞类型的TCRβ可变区-结合区（V-J）的片段组合情况进行可视化分析，每个弧表示一个V或J片段，根据数据集中情况对该段的相对比例进行缩放。每个弦代表一组克隆型，包括V-J组合，并根据数据的相对丰度进行加权。实验结果表明该试剂在鉴定各种克隆型组合时具有高度敏感性，是研究复杂样本的理想选择！
 
完整的TCR分析流程需要下列产品
产品名称 包装量 Code No.
  ICELL8® cx TCR Chip 1 Chip 640200
  ICELL8® Human TCR a/b Profiling - Indexing Primer Set 1 Set 640179
5 Set 640180
10 Set 640181
  ICELL8® Human TCR a/b Profiling Reagent Kit 1 Kit 640182
  ICELL8® Collection Kit - L 1 Kit 640212
  ICELL8® cx Loading Kit 1 Kit 640197
 
单细胞TCR免疫组库分析在提供丰富克隆型信息的同时，进一步展示了受体链的配对信息。这可以帮助研究人员深入了解T细胞的异质性、可塑性，分析配对方式对TCR抗原特异性识别的影响，设计治疗性抗体等。
Takara单细胞TCR-Seq产品引入了更多的对照，在处理复杂样品时可以帮助获得更高质量的数据。辅以友好的数据分析软件，让新手也可以从容应对！
 
此外，我们还推出了基于孔板的TCR & BCR测序建库方法：
新的TCR和BCR测序分析试剂盒了解下！
 
 

页面更新：2023-03-16 16:21:39


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