| sgRNA设计、制备、筛选知多少 |
| 在CRISPR/Cas9基因编辑系统中，如果Cas9是一把锋利的刀，那么sgRNA就是以一个“指挥”的形象在系统中出现，引导Cas9靶向地对目的基因进行敲除、插入、定点突变等编辑，使得定点基因组改变的难度明显降低，可进行操作的目标生物种类大大增加。 那么，对于如此重要的基因编辑实验元件，我们该如何对其进行实验前期的设计以及实验中的制备筛选呢？ |
| sgRNA设计 |
| 由于sgRNA负责将Cas9招募到特定的基因组位点进行定向切割，因此，sgRNA的设计作为基因编辑实验的第一步，对于实验能否成功至关重要。 一个完整的sgRNA包含用户自定义的靶向序列crRNA序列（CRISPR-derived RNA）和通用的Cas9核酸酶招募序列tracrRNA（trans-activating RNA），即sgRNA=crRNA+tracrRNA。crRNA序列是根据靶标基因特定位点自定义设计的，是与靶标位点同源的20个核苷酸序列，靶向不同的靶标基因就需要设计不同的自定义crRNA序列。以使用广泛的spCas9系统为例，设计sgRNA之前，应在目标基因组附近寻找PAM序列（PAM序列为NGG，N=A/T/C/G），基因特异的sgRNA模板序列为位于PAM序列前间区序列邻近基序。sgRNA通过“引导”Cas 9蛋白，可在PAM序列上游3-4个碱基处进行剪切，诱导细胞发生双链断裂，形成目的基因突变。 因此，我们可以针对自己感兴趣的基因，设计出实验所需的sgRNA。通过以往的实验经验，我们发现一个设计sgRNA的小技巧。当sgRNA的第一个碱基为G，第17个碱基为A或T时，基因编辑实验效率会有所提升。除了自己手动设计以外，现在也有许多网站可用于设计高靶标特异性、低脱靶效应的sgRNA。 Takara整理了用于sgRNA设计的网页工具列表，欢迎点击访问查看！ |
| sgRNA制备与筛选 |
| 在完成sgRNA的设计后，我们需要制备可以进行高效实验的sgRNA。但由于我们无法确定sgRNA的特异性和在实际实验中的效率，因此，实验中我们通常会设计多种不同的sgRNA来靶向目的基因，并从中筛选出较高实验效率的sgRNA用于基因编辑实验，这样可以大大降低使用无效或者低效率sgRNA的风险。 |
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| Guide-it sgRNA体外转录试剂盒可以用于合成您的sgRNA。使用该试剂盒，通过PCR在T7启动子的控制下生成包含sgRNA编码序列的模板DNA。然后，使用PCR产物模板进行体外转录以产生可纯化并进行效率测试或转导的sgRNA。 |
| Guide-it sgRNA 筛选试剂盒可以用于在细胞转导前sgRNA 效率评估，使您能够确定高效的sgRNA。 |
| 产品特点： |
| ·调整了转录起始位点，sgRNA产量可达12 μg以上。 ·采用PrimeSTAR Max PCR扩增模板DNA，可减少非特异性扩增，原则上不需要切胶回收。 ·采用Clean-Up Kit柱式纯化sgRNA，不需要进行苯酚/酚氯仿抽提纯化。 ·采用Terra PCR Mix制备目的DNA，可以直接以细胞为起始进行PCR。 |
| 实验案例： |
| 1. 以不同基因为靶标制备的sgRNA产量和品质比较 |
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| Panel A. 将20 μl sgRNA体外转录（IVT）反应液置于37°C孵育4 hr，采用NanoDrop分光光度计检测所制备产生的sgRNA产量。 Panel B. 采用安捷伦生物分析仪分析每一个sgRNA IVT反应液，检测sgRNA质量。 |
| 2. Guide-it试剂和其他公司同类产品所制备的sgRNA品质比较 |
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| 采用Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit制备的所有sgRNAs均为单一条带，而使用其他公司同类产品制备的sgRNAs均可观察到杂带，因此Guide-it试剂盒所制备的sgRNAs品质更高（Takara Bio USA, Inc.比较结果）。 |
| 3. HeLa细胞CXCR4基因体外剪切效率和体内敲除效率比较 |
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| 采用Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit制备的所有sgRNAs均为单一条带，而使用其他公司同类产品制备的sgRNAs均可观察到杂带，因此Guide-it试剂盒所制备的sgRNAs品质更高（Takara Bio USA, Inc.比较结果）。 |
| 以敲除Hela细胞中的CXCR4靶基因为例。 |
| Panel A. 通过电泳结果图可以看出，在所制备的4条sgRNA中，3号sgRNA的体外剪切效率是最低的。 Panel B. 将4条sgRNA分别导入至HeLa细胞进行基因编辑，分别再使用突变检测试剂盒和流式来检测基因敲除效率，检测结果显示同样是3号sgRNA的基因敲除效率最低。 |
| 以上实验结果说明：sgRNA的体外剪切效率和体内敲除效率之间是具有一定的相关性的。 |
| 632636 Guide-it™ Complete sgRNA Screening System产品应用文献： [1] Khadka P, Reitman ZJ, Lu S, et al. PPM1D mutations are oncogenic drivers of de novo diffuse midline glioma formation. Nat Commun. 2022;13(1):604. [2] Morizako N, Butlertanaka EP, Tanaka YL, et al. Generation of a bovine cell line for gene engineering using an HIV-1-based lentiviral vector. Sci Rep. 2022;12(1):16952. [3] Mizushima S, Sasanami T, Ono T, Matsuzaki M, Kansaku N, Kuroiwa A. Cyclin D1 gene expression is essential for cell cycle progression from the maternal-to-zygotic transition during blastoderm development in Japanese quail. Dev Biol. 2021;476:249-258. [4] Sreedurgalakshmi K, Srikar R, Harikrishnan K, Srinivasan L, Rajkumari R. Cetuximab-siRNA Conjugate Linked Through Cationized Gelatin Knocks Down KRAS G12C Mutation in NSCLC Sensitizing the Cells Toward Gefitinib. Technol Cancer Res Treat. 2021;20:15330338211041453. |
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页面更新：2023-01-17 15:19:48
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