| Y2H+NGS，酵母杂交新思路！ |
| 众所周知，酵母双杂交技术 (Y2H) 是一种成熟的用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的技术。为满足当前解开复杂蛋白质互作网络的需求，国内外学者通过对建立中高通量Y2H筛选平台进行调整，已成功将Y2H与下一代测序 (NGS) 技术相结合，以此来增加筛选的规模和方法的灵敏度。今天，小编就带您了解一下其中两个方法。 |
| ■ 方法一：rec-YnH |
| 该方法能够同时多对多检测直接的蛋白质-蛋白质和蛋白质-RNA 相互作用。使用批量克隆、转化与细胞内同源重组相结合的方法生成诱饵-猎物融合文库，在液体凝胶中进行相互作用选择，并通过使用基于 ORF 序列的下一代测序（NGS）验证相互作用，消除了现有方法所需的费力铺板等步骤，工作流程更加简单且节省经费。 |
| 文献案例 |
| Lang, Benjamin, et al. "Matrix-screening reveals a vast potential for direct protein-protein interactions among RNA binding proteins." Nucleic acids research (2021): 6702-6721. |
| ·背景 |
| RNA 结合蛋白 (RBPs) 是转录后基因调控的关键因素，RBP从转录的初始时刻开始与 RNA 进行相互作用，指导 RNA 加工、核输出、细胞质定位、翻译和衰变等。RBP对于在时间、空间和细胞环境中引导基因表达至关重要，它的作用模式被深入研究，迄今为止，已经发现了数百个 RBP，并且已经研发了许多方法来了解哪些 RNA 与哪些 RBP具有相互作用以及互作位置。尽管如此，RBP-RNA 相互作用的决定因素仍然是一个具有激烈争议的研究领域。 |
| ·方法 |
| 为了系统地寻找直接的RBP相互作用，作者组装了一个含有978个哺乳动物RNA结合蛋白，76个微管相关蛋白（MAPs）的RBP库，使用高通量重组酵母双杂交（rec-Y2H）筛选来检测1054个蛋白质之间>100万个相互作用。 |
| ·说明 |
| 本文作者使用了Takara的Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System进行rec-Y2H分析，Matchmaker Gold酵母双杂交系统用于研究蛋白质—蛋白质相互作用。系统是采用3个启动子、4个报告基因共同筛选，有效降低假阳性！ |
| ·结论 |
| 最终检测到1994种新的RBP相互作用, 同时验证了422种以前报道的相互作用。还发现RBP的mRNA结合区域和基序偏好会因为他们相邻的结合互作伙伴不同而有所不同，揭示了主要 RNA 加工步骤之间新的RBP相互作用网络，并发现了在癌症中观察到的剪接损伤RBP突变重新连接剪接体相互作用网络。这些数据有助于理解蛋白质-RNA 相互作用、RNA 代谢和基因表达的基本原理。 |
| ■ 方法二：Y2H-seq |
| 将Y2H筛选与下一代测序 (NGS) 相结合，可以减少工作量和成本，同时提高灵敏度，并且能够快速识别所选生物体中感兴趣的诱饵蛋白质的相互作用蛋白质。选定的诱饵蛋白质和数以千计的猎物蛋白质以阵列形式生长，分别配对汇集。NGS缩小了猎物池的范围，最终通过选择性培养基上的大规模斑点分析检测相互作用。Y2H-seq 筛选方法生成定量读数，通过控制筛选可以消除假阳性以提高特异性，从而可以减少下游一对一相互作用验证实验。此外，该方法依赖于 cDNA文库，适用于所有生物体。 |
| 文献案例 |
| Chen, Xi, et al. "Determination of conifer age biomarker DAL1 interactome using Y2H-seq." Forestry Research (2021): 1-12. |
| ·背景 |
| 年龄作为一种复杂的生理信号，可确保生物体不同发育阶段的顺序。对于针叶树种，通常具有十分漫长的童期，且针叶树具有明显的年龄效应，无性繁殖困难，所以针叶树年龄决定机制的全面解析至关重要。DAL1曾被鉴定为油松年龄标志因子，在油松从营养生长阶段到生殖生长阶段的过渡中起重要的作用，阐明与 DAL1 相关的相互作用是了解年龄如何驱动油松发育的关键。 |
| ·方法 |
| 作者开发Y2H-seq 方法，运用该方法对油松年龄标志因子DAL1互作蛋白进行了大规模筛选。 |
| ·说明 |
| 在 Y2H 检测中，使用了Takara 的pGBKT7 (DNA-BD) 和 pGADT7 (AD)载体；用于构建诱饵蛋白质PtDAL1 和不同年龄段油松cDNA文库；这两个载体作为Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System的组分，在酵母双杂交中被广泛使用。 |
| ·结论 |
| 共鉴定出与油松PtDAL1具有直接相互作用的蛋白质135个，这些蛋白质具有由转录因子 (TF)、转录调节因子 (TR) 和激酶组成的复杂相互作用网络，与衰老过程有关；同时，这些蛋白质是响应多种植物激素而产生的环境信号，可能参与木材形成、针叶发育、油树脂萜类生物合成和生殖发育过程。本文作者提出了一种油松衰老的新调控模型，PtDAL1通过协调环境刺激并与多种重要调控因子产生相互作用，从而调节油松不同年龄段的生长发育，为油松及其它相关针叶树种年龄调控机制研究提供了科学依据。 |
| 酵母双杂交 (Y2H) 与下一代测序 (NGS) 的结合，加大了筛选互作规模的同时提高灵敏度，减轻了实验数据采集和重复筛选的劳动力成本，为绘制大规模的蛋白互作网络图谱提供了可能，给广大科研学者带来研究大规模蛋白质互作高效的新思路！ |
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| 参考文献！ |
| 1. Erffelinck, Marie-Laure, et al. "A user-friendly platform for yeast two-hybrid library screening using next generation sequencing." PLoS One (2018): e0201270. 2. Yang, Jae-Seong, et al. "rec-YnH enables simultaneous many-by-many detection of direct protein–protein and protein–RNA interactions." Nature communications (2018): 1-13. |
页面更新：2022-06-24 13:48:20
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