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多国现不明原因儿童肝炎病例,病毒宏基因组助力检测!
 

自从新冠病毒疫情爆发以来,大家对流行病和传染病的关注也与日俱增。最近,全球多个国家和地区出现了不明原因儿童严重急性肝炎(acute severe hepatitis of unknown aetiology in children,ASHep-UA)病例报告,而且重症病例占比较高,引起了人们广泛关注。

为提前做好医疗救治准备,6月16日,国家卫健委发布《不明原因儿童严重急性肝炎诊疗指南(试行)》(下简称诊疗指南)

 
病因和发病机制说明
诊疗指南中指出:不明原因儿童严重急性肝炎的病因和发病机制尚在研究中。目前WHO认为,尽管将腺病毒感染作为病因的假说有一定合理性,但腺病毒通常引起低龄儿童轻度、自限性的消化道或呼吸道感染,不能完全解释该病一些较严重的临床表现,故该病与腺病毒的关联需进一步明确。大部分患儿未接种过新冠病毒疫苗,不支持该病与新冠病毒疫苗副作用有关的假说。其他致病因素尚在探索中,例如新冠肺炎流行期间,腺病毒流行水平较低致儿童易感性增加;出现新型腺病毒;腺病毒合并新冠病毒感染;新冠病毒感染并发症导致超级抗原介导的免疫细胞活化,从而引起儿童多系统炎症综合征等。对其他病原体的探索也在进行中,非感染性因素也需进一步排除。
 
Tip:儿童多系统炎症综合征(multisystem inflammatory syndrome in children,MIS-C)
MIS-C是一种由SARS-CoV-2感染后引发的严重的、不受控制的炎症反应,涉及多器官。
 
【MIS-C研究的文献案例】
来自洛杉矶Cedars-Sinai医学中心的研究人员利用蛋白质组学、RNA-Seq、自身抗体阵列以及BCR-Seq等技术,阐述了MIS-C的免疫发病机制,并进一步确定导致重症症状以及重症监护病房入院的因素。相关成果发表在《J Clin Invest》上题为The autoimmune signature of hyperinflammatory multisystem inflammatory syndrome in children一文中。

在本研究中,样本包括轻度MIS-C (n=7)、重度MIS-C (n=20)、KD (n=7,COVID 19发生之前收集到的川崎病患者样本)、健康对照(n =20)、发热对照组(n=15)。其中,92%的MIS-C血清样本和100%的KD血浆样本在IVIG给药前采集。使用Takara的SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3- Pico Input Mammalian(Pico v3,后文会进一步介绍说明)构建10 ng total RNA起始的测序文库,并使用Illumina Novaseq 6000(PE 50)进行测序分析。
 
宏基因组测序应用于不明原因儿童肝炎的病原学检查
诊疗指南中建议:当核酸检测、抗原检测和血清特异性抗体检测的病原学检查阴性,临床高度疑似的感染者,可对血、肝穿刺组织等样本进行宏基因组二代测序。
 
·说明
本文作者使用了Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System进行rec-Y2H分析,Matchmaker Gold酵母双杂交系统用于研究蛋白质—蛋白质相互作用。系统是采用3个启动子、4个报告基因共同筛选,有效降低假阳性!
 
由于其不依赖微生物培养,可以直接对临床样本中的核酸进行测序的特点,宏基因组测序技术已经成为病原检测的重要技术手段。整个基因测序流程一般包括样本准备、文库构建、上机测序和生物信息学分析等步骤。通过NGS技术可以直接获得病毒的全基因组序列,进而分析病毒基因,为不明原因儿童肝炎的临床治疗和后续研究提供帮助!
 
但是,科研人员往往面临病原微生物核酸含量低、宿主核酸污染、实验流程复杂等问题,Takara病原微生物NGS文库构建解决方案,能又快又好地帮您完成以下领域的分析。
 
Takara 病原检测解决方案
 
■微量样品的可靠宏基因组分例
在某些情况下,以非常少量的临床样本作为研究对象进行宏基因组分析是难免的,这类样本包括临床拭子、体液、少量组织等。ThruPLEX DNA-Seq Kit支持50 pg-50 ng DNA起始,单管操作、手动15 min、总共两小时,过程中无需转管与纯化,轻松应对宏基因组建库难题!
 
【文献案例】
瑞典卡罗林斯卡医学院的Dr. Nanna Fyhrquist团队在Nature Communications杂志上发表了题为Microbe-host interplay in atopic dermatitis and psoriasis的文章,采用宏基因组学结合16s rRNA测序、宿主转录组测序分析技术,探讨过敏性皮炎、银屑病及健康人皮肤表面微生物群落特征,并与宿主皮肤转录组数据进行关联分析。

结果显示,过敏性皮炎与银屑病皮肤样品具有各自特有的微生物群落特征,并都与健康人样本的数据存在差异。其中,过敏性皮炎样本的优势菌为Staphylococcus aureus,与皮肤屏障功能、色氨酸代谢及免疫激活等宿主转录组数据有相关性;银屑病样本显示出共生的微生物群落结构,并与宿主疾病相关基因的表达存在弱相关性。

本案例中,作者使用皮肤拭子采集皮肤微生物样本,采用ThruPLEX DNA-Seq Kit完成宏基因组文库构建,起始DNA量为50-300 pg,非常微量!该试剂盒具有操作简便,所构建文库覆盖度均一、多样性好、duplicates比例低等特点,助力Dr. Nanna团队获得了可靠的宏基因组数据,为后续皮肤炎症biomarker的发现及靶向治疗提供了数据支持!
 
■突破低起始量微生物样本的宏转录组项目研发瓶颈
在使用临床样本进行病原微生物NGS分析时,往往会遇到样本含量少、样本背景复杂、宿主核酸干扰大、建库过程PCR扩增不均一等一系列问题,给正确分析病毒基因组信息造成困难。Takara提供的宏转录组建库解决方案,以其快速、简便、高效的特点,已被大量用于RNA病原微生物的检测分析!
 
 
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian
【产品特色】
·50 pg-10 ng 的total RNA起始量,样本稀少也能高效建库!
·无需担心RNA降解,兼容不同品质的RNA样本 (RIN2-10或DV200>25%)!
·操作简便时间短,不需要前处理rRNA, 6小时内完成Illumina文库构建!
·非编码与编码同时分析,随机引物起始,捕获全转录组信息!
 
【文献案例】
复旦大学张永振教授团队通过测序分析了新冠病毒基因组序列,该病毒基因组来自一名41岁的男性患者,相关成果发表在Nature杂志题为A new coronavirus associated with human respiratory disease in China的文章中。本研究对200 μL肺泡灌洗液(BALF)样本提取总RNA,使用Illumina MiniSeq(PE 150)进行深度宏转录组测序,确定了该病毒的基因组。同时进行系统进化分析,发现与一组来自于中国蝙蝠SARS样冠状病毒基因组相似度达到89.1%。作者使用了SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2- Pico Input Mammalian制备宏转录组文库,通过核心的ZapR v2、Rprobes v2技术在建库过程中去除了人源rRNA!
 
【应用文献】
Pettersson JH, et al. Meta-transcriptomic identification of hepatitis B virus in cerebrospinal fluid in patients with central nervous system disease.[J]. Diagnostic microbiology and infectious disease, 2019,95(4).
 
研究人员采用宏转录组技术研究中枢神经系统综合征患者脑脊液中的HBV病毒。使用了SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v2 - Pico Input Mammalian构建宏转录组文库(所用的样本为150 μl脑脊液,total RNA浓度为50-200 pg/μl)。
 
SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit v3 - Pico Input Mammalian
【产品特色】
·通过添加UMI,更加灵敏地识别PCR重复片段并校正测序错误!
·同样无惧RNA降解,能分析质量较差的RNA样本!
·支持皮克级总RNA起始,快速高效的构建测序文库!
 
相信随着研究的不断深入,技术的不断发展,我们会对不明原因儿童肝炎会有更新的认识和诊疗方案。同时也相信病毒宏基因组将继续在病原微生物诊断和监测方面发挥重要作用。
 
 

页面更新:2022-06-24 10:21:00