| 无需RNA纯化，生物样本直接qPCR—多种病原菌检测实例 |
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| 2019年，Takara发布了无需RNA提取，可直接使用生物样本进行定量PCR的新产品PrimeDirect™ Probe RT-qPCR Mix (or with UNG)（Code No.RR650/651）。 |
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点击链接，了解德国科学家使用RR650构建不需要RNA提取的快速新冠病毒qPCR检测新方法。
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| 下面介绍一下使用直接qPCR方法进行甲流病毒、金黄葡萄球菌、寨卡病毒检测的实验例。 |
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| 实验例1 甲型H1N1流感灭活病毒的检测 |
| 我们使用PrimeDirect™ Probe RT-qPCR Mix直接对生物样本进行H1N1检测。 |
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实验样本
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| 将灭活甲型流感病毒以2×100-102 copies/μl的浓度加入口腔拭子样本、鼻拭子样本和唾液样本中。 |
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| 检测样本 |
说明 |
| 口拭子 |
将取样的口拭子浸泡在200 μl PBS缓冲液中，摇匀5秒，然后向反应液中添加1 μl上清液。 |
| 鼻腔拭子 |
将取样的鼻腔拭子浸泡在200 μl PBS缓冲液中，摇匀5秒，然后向反应液中添加1 μl上清液。 |
| 唾液 |
直接向反应液中添加1 μl上清液。 |
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反应体系
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| 组分 |
液量（μl） |
| PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix (2X) |
12.5 μl |
| Forward Primer (10 μM) |
0.5 μl |
| Reverse Primer (10 μM) |
0.5 μl |
| qPCR probe (10 μM) |
0.5 μl |
| 样本 |
1 μl |
| 甲型流感病毒H1N1 (2×100-102 copies/μl) |
1 μl |
| RNase Free H2O |
9 μl |
| Total |
25 μl |
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反应结果
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| 扩增曲线如下图，鼻腔拭子和唾液样本的检测灵敏度为20拷贝，口腔拭子样本的检测灵敏度为2拷贝。 |
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| 实验例2 全血中的金黄葡萄球菌检测 |
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实验样本
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| 全血（肝素血及EDTA血）及其10倍稀释液（PBS）中加入1×101～105 cfu/μl浓度的金黄葡萄球菌。制备好后各使用1 μl。 |
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| 引物／探针检出范围： 16S rRNA基因（Cy5标记） |
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反应体系
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| 组分 |
液量（μl） |
| PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix, with UNG (2X) |
25 μl |
| Forward Primer (10 μM) |
1 μl |
| Reverse Primer (10 μM) |
1 μl |
| TaKaRa qPCR Probe (10 μM) |
1 μl |
| 血液样品（含金黄葡萄球菌） |
1 μl |
| RNase Free H2O |
21 μl |
| Total |
50 μl |
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反应条件
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| 90℃ |
3 min |
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| 60℃ |
5 min |
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| 95℃ |
5 sec |
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40 Cycles |
| 60℃ |
30 sec |
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结论
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| 虽然使用血液成分进行检出时有阻害，但是PrimeDirect Mix在全血原液中（肝素血、EDTA血）可直接检出100 cfu，其10倍稀释液也可以直接检出10 cfu的金黄葡萄球菌。该实验显示，1 μl全血中如果存在100 cfu的金黄葡萄球菌，可以检出。 |
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| 实验例3 Zika（寨卡）病毒检测 |
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实验样本
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| 在尿液及其10倍稀释液（生理盐水）中，加入2×103 copies/μl浓度的NATtrol Zika Virus（ZeptoMetrix公司）制备起始样品，然后各使用1 μl。 |
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| 引物／探针检出范围： Polyprotein基因（ROX标记） |
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| 组分 |
液量（μl） |
| PrimeDirect Probe RT-qPCR Mix, with UNG (2X) |
12.5 μl |
| Forward Primer (10 μM) |
0.5 μl |
| Reverse Primer (10 μM) |
0.5 μl |
| TaKaRa qPCR Probe (10 μM) |
0.5 μl |
| 尿液样品（含Zika virus） |
1 μl |
| RNase Free H2O |
10 μl |
| Total |
25 μl |
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反应条件
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| 90℃ |
3 min |
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| 56℃ |
5 min |
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| 95℃ |
5 sec |
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40 Cycles |
| 56℃ |
30 sec |
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结论
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| PrimeDirect Mix不易受尿原液的阻害，可直接检出尿液中的Zika病毒。 |
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检测灵敏度
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| 尿原液中分别添加浓度为2×10-2～103 copies/μl NATtrol Zika Virus制备起始样品，各使用1 μl，使用上面相同的反应体系和反应条件。 |
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PrimeDirect Mix不易受尿液阻害，尿液中的Zika病毒2个拷贝以上即可检出。
感染者的尿液中该病毒RNA浓度为2.1x10 copies/μl的案例也有报道，使用本试剂能够满足检出灵敏度。
Zika 病毒感染者尿液中病毒RNA浓度的案例：(https://www.niid.go.jp/niid/ja/id/2358-disease-based/sa/zika-fever/7169-zikara-11-170331.html) |
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我们对全血中Zika病毒检测，也得到了类似结论。
血液成分对检出虽然有阻害作用，但全血10倍稀释液中的Zika病毒2拷贝以上可以检出。显示出在全血原液1 μl中存在20拷贝左右的Zika病毒时，可以检出。 |
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众多实验例充分证明，PrimeDirect™ Probe RT-qPCR Mix (or with UNG)（Code No.RR650/651）在直接qPCR检测方面有着良好的表现，血液、尿液、粪便、细胞可以直接进行病毒或细菌的一步法RT-qPCR，大大提高了操作简便性，减少了反应时间，可以简便、低成本地进行qPCR检测。
另外，Takara基于至今为止积累的技术和经验，提供使用本产品制造基因检测kit的定制生产，提供更适合的Real Time PCR检测试剂。 |
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| 从基因分析领域的基础研究到产业应用，Takara将持续不断推出各种用途的新产品和服务，从而进一步扩大生物产业支援事业。 |
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