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PicoPLEX技术助力辅助生殖研究
 
辅助生殖技术(包括人类辅助生殖技术和人类精子库)是指运用医学技术和方法对配子、合子、胚胎进行人工操作,以达到受孕目的的技术,分为人工授精技术、体外受精-胚胎移植技术及相关衍生技术【1】
 
其中体外受精-胚胎移植技术及其各种衍生技术(In vitro fertilization, IVF)近些年来备受关注。简单的说,就是大家耳熟能详的试管婴儿技术。
 
“试管婴儿”的前世今生?
1978年世界上首例试管婴儿诞生,从此开创了生殖医学领域的新纪元。
试管婴儿是指从女性体内取出卵子,在器皿内培养后,加入经技术处理的精子,待卵子受精后,继续培养,到形成早早期胚胎时,再转移到子宫内着床,发育成胎儿直至分娩的技术【1】
 
试管婴儿技术的分类
 
第三代试管婴儿的分类
 
为什么选择PGT-A?
虽然试管婴儿技术给不孕不育的夫妇带来了希望,但胚胎染色体数目异常在常规体外受精中较常发生,且高龄女性胚胎染色体异常的发生率更高。
PGT-A技术,对植入前的胚胎细胞进行染色体非整倍体以及染色体拷贝数变异检测,选择染色体数目正常的胚胎,可有效提高体外受精的成功率,有助于辅助生殖技术的推广应用。
 
PGT-A的研究方法
前几年主要通过荧光原位杂交(FISH)技术、比较基因组杂交芯片(aCGH)技术进行PGT-A分析。随着二代测序(NGS)的快速发展,人们将目光转向NGS方法,以期进行更正确的评估。
 
PGT-A研究的难点之一是选择合适的单细胞全基因组扩增技术
基于NGS技术进行PGT-A研究时,由于每个胚胎细胞中的DNA非常少(皮克级),远没有达到测序所需的样品量,因此需要先对单细胞内的DNA进行全基因组扩增(whole genome amplification, WGA),而这一过程必须尽可能避免样本的损失和污染,并尽可能保证扩增的覆盖度、均一性等,这都是极其困难的,所以选对单细胞全基因组扩增技术很重要
 
Takara致力于通过卓越的技术为科学研究提供支持,倾力推出的PicoPLEX技术,目前广泛用于PGT-A研究。接下来让我们一起来看一下:
 
PicoPLEX技术是如何正确而高效的进行PGT-A研究
■ 操作简便,避免珍贵样品的损失
整个实验过程是 “飞一般的感觉”(见下图),就三小时,就三小时(细胞裂解→预扩增→低背景的PCR扩增),便可获得微克级的DNA产物。过程中不需要转管和纯化,减少过多实验操作可能带来的样本损失!
 
 
■ 炫酷的“准线性预扩增+发夹结构”加持,保证扩增的均一性
在经过细胞裂解后,以DNA作为模板使用准线性扩增方法进行预扩增,并在每个循环最后形成一个不能被进一步扩增的发夹结构,这样做的好处是有效避免PCR过程中可能引入的扩增错误无限放大,避免序列偏向性。
 
■ 可用于高品质的染色体变异(CNV)分析
利用单卵裂球活体组织检查样品进行PicoPLEX WGA Kit扩増标记后,与24 sure array杂交,结果清晰地显示了CNV(上图)。2011年ESHRE(欧洲人类生殖与胚胎学会)的临床实验证明了采用PicoPLEX 技术进行人类染色体核型分析的准确性。
 
■ 实例大公开:进行PGT研究时,PicoPLEX性能出色
来自西班牙Sistemas Genómicos Ltd.的Vendrell【2】的团队,开发了一种高度可靠的检测单个卵裂球和5-10滋养外胚层细胞样品的染色体异倍性的实验方法。其中使用PicoPLEX试剂盒扩增获得gDNA产物用于后续NGS分析。实验表明,未扩增的对照DNA样品和来自单个卵裂球的WGA产物在测序数据上基本没有差异,且可以正确地检测染色体异倍性。
表明使用PicoPLEX技术具有高再现性,适用于PGT-A分析。
 
拓展:无创胚胎植入前非整倍体基因检测(niPGT-A)
尽管胚胎活检被认为是一种相对安全的方法,但其他侵入性较小的技术最近也受到关注。研究表明,可以通过检测释放到培养基中的游离DNA(cfDNA),即无创胚胎植入前非整倍体基因检测(niPGT-A)来判断胚胎非整倍体情况。由于cfDNA的含量远少于侵入式活检的细胞DNA,因此具有高灵敏度和低偏差的WGA方法对于niPGT-A获得足够的材料进行下游分析至关重要。
来自南加州大学的Jacqueline团队【3】,通过对废胚胎培养基(SEM)中提取的cfDNA进行全基因组扩增,分析胚胎染色体的非整倍性,验证无创胚胎植入前基因检测非整倍体检测(niPGT-A)的可靠性。实验分别对SEM,滋养外胚层细胞和完整胚胎样本使用PicoPLEX进行WGA,然后利用NGS方法进行PGT-A分析。结果表明,使用63.2 ng/ul的cfDNA足以用于正确的进行染色体异倍性分析,但一致性略低。这也表明,PicoPLEX技术可以提供高质量的基因组DNA, 助力niPGT-A分析。
 
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参考信息及文献来源
1. 中华人民共和国国家卫生健康委员会官网
2. Vendrell, X. et al. New protocol based on massive parallel sequencing for aneuploidy screening of preimplantation human embryos. Syst. Biol. Reprod. Med. 63, 162-178 (2017).
3. Ho, J. R. et al. Pushing the limits of detection: investigation of cell-free DNA for aneuploidy screening in embryos. Fertil. Steril. 110, 467-475.e2 (2018).