“生物通2016年十大创新产品”评选获奖产品：
高灵敏度的人T细胞受体（TCR）库分析方法 |
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创新点：
采用SMART RACE技术和LNA™技术，可以无偏扩增TCR mRNA序列，捕获TCR V(D)J完整可变区域，并具有很高的灵敏度。顾名思义，本试剂可以在同一实验或单独实验中获得TCR-α和β链多样性数据。构建的文库添加了index序列可直接用于Illumina®测序平台测序。 |
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| 目前，NGS技术已经越来越多地应用于人类T细胞受体（TCR）多样性的研究。不过，在利用传统方法生成TCR测序文库时，往往只包含TCR可变区的一部分，而且需要用到复杂的多重PCR策略。为此，Takara旗下Clontech近日推出了一个新的解决方案。 |
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| SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit为那些利用NGS开展TCR免疫组库分析的研究人员带来了一个强大的方案。它以RNA样本或淋巴细胞作为起始材料，采用类似5’ RACE的策略来捕获TCR转录本中完整的V(D)J可变区。 |
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| 这个试剂盒接受的RNA起始量很广泛。有研究表明，从外周血白细胞中获得的10 ng至3 μg RNA可产生高质量的测序文库。您甚至可以直接从完整的淋巴细胞开始，用50至10,000个纯化的T细胞制备文库。 |
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| 顾名思义，这个试剂盒能够产生TCR-α和TCR-β链多样性的数据，这些可以单独获得或同时获得。与以往的多重PCR方法不同，每一轮的文库扩增使用一对引物来扩增每个TCR亚基。制备好的文库已经带有索引，可立即在Illumina平台上测序。 |
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| SMARTer Human TCR a/b Profiling Kit利用了Clontech成熟的SMART技术以及Exiqon公司的LNA™技术，以无偏向的方式扩增TCR的mRNA序列。首先开展第一链cDNA合成，在合成链的3’端添加一些非模板的核苷酸。之后，SMART-Seq v4 Oligonucleotide与这些核苷酸退火，并作为模板，在第一链cDNA上掺入更多的核苷酸。这也就是模板转换的步骤。掺入的核苷酸，又称为“SMART序列”，将作为后续PCR的引物退火位点，保证只有全长的cDNA经过扩增。 |
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| 之后是两轮PCR，扩增TCR-α和TCR-β可变区所对应的cDNA序列。第一轮的正向引物与SMART序列互补，而反向引物则有两个，分别对应TCR-α和TCR-β，若需要分析两个TCR亚基，则可同时加入。第二轮PCR则以第一轮的产物为模板，利用半巢式引物扩增整个可变区和部分恒定区。在PCR后，经过纯化、大小选择和定量，文库即可用于测序。 |
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| 图1. SMARTer 法文库构建流程及TCR多样性分析PCR策略 |
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| 这个试剂盒具有出色的灵敏度和重复性。实验表明，即使样品起始量存在差异，它依然能获得一致的结果。同时，它也实现了低丰度TCR序列的检测。在免疫组库分析上，它也可以助您一臂之力。 |
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| 图2 SMART技术重复性和灵敏度分析。以PBMC RNA样品中分别掺入不同浓度（10%，1%，0.1%，0.01%和0.001%）的同源白血病Jurkat T细胞RNA（TRAV8-4-TRAJ3，TRBV12-3-TRBJ1-2克隆型）为起始，利用SMARTer技术构建文库。对每一个混合文库测序获得的TRBV12-3-TRBJ1-2相关的读段数量通过扣除阴性对照（PMBC RNA）的读段数进行均一化处理。分析表明，SMARTer技术构建的测序文库对不同丰度的特定TCR克隆型的分析是可信、可重复的（Panel A）。利用SMARTer技术构建文库，可以对掺入量为0.1%的Jurkat RNA进行有效测序，证明了SMARTer技术的灵敏性（Panel B）。 |
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