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实验例-Poly(A)序列后冗余碱基对IVT合成mRNA在细胞内蛋白表达的影响

A. 模板质粒的线性化设计对IVT合成mRNA的细胞内蛋白质表达的影响

【方法】
Firefly Luciferase (FLuc) mRNA编码的三种模板质粒[pFLuc-142A (BspQ I)， pFLuc-102A (BspQ I)和pFLuc-105A (Hind III)]^*1分别使用Poly(A)序列后的不同限制性酶位点进行切割，使用CleanCap进行体外转录 (IVT)合成mRNA^*2。最后将每个0.5 μg的mRNA转入HEK293T细胞中，培养24小时后对Fluc活性进行测定。
*1三种质粒序列除了Poly(A)序列长度和Poly(A)序列后的限制酶位点以外都是相同的。
*2样本名表示mRNA的Poly(A)序列长度、用于线性化的限制酶以及Poly(A)序列后的冗余碱基数(括号内)。
【结果】
在任何一种质粒中，随着Poly(A)序列后的冗余碱基数量的增加，FLuc蛋白质的表达量大幅降低。由此表明，模板质粒的线性化设计对目的蛋白质在细胞内的表达有很大影响。

B. mRNA的Poly (A) 序列长度的增加会提高细胞内蛋白质的表达量

【方法】
关于Poly(A)序列长度的增加(约40个碱基)和Poly(A)序列后3个冗余碱基的影响，FLuc的蛋白质表达是否有明显差异，以n=4进行了与A相同的实验。
【结果】
FLuc mRNA的Poly(A)序列长度增加40个碱基时，蛋白质表达明显提高[141A - BspQ I (0) vs. 101A - BspQ I (0); 28.5% (p=0.026)，141A-BspQ I (0) vs. 105A - Hind III (3); 28.9% (p=0.017)]。因此，使用Template Vector (BspQ I) for T7 mRNA Synthesis构建的质粒模板可以替换Linearized Template Vector(Code No. 6143)并能够制备出更高表达的目的mRNA。另一方面，Poly(A)序列长度相近的101A - BspQ I(0)和105A - Hind III (3)， FLuc蛋白质的表达差异非常小(p=0.959)。因此，可以确认，3个冗余碱基对蛋白质的表达影响非常小。