In-Fusion Cloning:连接酶的高效率高准确度替代方法

 
【数据提供】
研究1: Ti-yu Lin, Graduate Student, Univ. of Wisconsin-Madison
研究2: Madhusudan Rajendran, Research Assistant, Univ. of Wisconsin-Madison
 
【实验简介】
在下面这些研究中,In-Fusion Cloning被用于传统连接酶方法不成功的克隆实验。两个实验都使用了pET载体,这是一种常用的体内重组蛋白质表达系统。当使用连接酶时,两位研究人员都无法克隆获得想要的片段:Ti-yu Lin的目的片段为~1 kb并高GC含量(67%GC),Madhusudan Rajendran使用编码novobiocin抗性的大插入片段(gyrase B; 2.4 kb)。
 
使用In-Fusion克隆,两位科学家都能够有效地将其片段克隆到限制酶消化的线性化载体中,通过菌落PCR筛选确定阳性克隆。虽然每个项目的具体细节都有不同的挑战,但结果是相同的:In-Fusion技术在第一次尝试时就产生了阳性克隆,并且手动操作时间很短。
 
【实验结果】
PCR扩增目的片段显示了两个正确大小的单一条带(图1),将这些片段克隆到它们各自的目的载体中(图2), 随后通过菌落PCR分析。对于研究1,由In-Fusion克隆方法产生的10个菌落中的8个是阳性克隆。对于研究2,32个筛选的菌落中有21个是阳性克隆。在这两种情况下,研究人员都能够成功地将目的基因进行克隆。
 
图1. 目的片段的PCR扩增。使用CloneAmp HiFi PCR Premix从基因组DNA模板扩增目的基因。 PCR引物将In-Fusion Cloning重叠序列引入到PCR产物的5'和3'末端。(图A)研究1,插入片段~1 kb插入。(图B)研究2,插入片段2.4 kb。
 
【用户感言】
“这个试剂盒的效果超出我们的预期。PCR产物纯化试剂盒回收了高浓度DNA(~90 ng /μl)。 此外,我使用常规连接方法没能获得任何阳性克隆,而使用In-Fusion克隆,我能够获得21个阳性克隆。谢谢你们的帮助!”
-Madhusudan Rajendran, UNIV. OF WISCONSIN-MADISON
 
图2. 菌落筛选。菌落PCR用于确定阳性克隆。(图A)在研究1中,检测的10个菌落中有8个显示~1.3 kb的条带,为阳性克隆。(图B)在研究2中,检测的32个菌落中的21个显示~2.6 kb的条带,为阳性克隆。
 
【结论】
先前基于连接酶方法的克隆工作未能产生令人满意的结果,但使用In-Fusion HD Cloning Plus后,两个独立的项目都得到了阳性克隆。在每次尝试中,两位研究人员都能够成功地将其具有挑战性的插入片段克隆到pET表达载体中。
 
 
 
详细实验方法和步骤请见:
https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tech-notes/a-successful-alternative-to-ligation-cloning