利用In-Fusion Cloning插入小的融合蛋白质标签

 
【数据提供】Fabio Antenucci
Post-doctoral research fellow, Veterinary Clinical Microbiology, University of Copenhagen
 
【产品亮点】
· 克服了限制酶位点的限制
· 无需标签模板也可添加小的蛋白质标记(<10 aa)
· 一步反应将多个片段和标签插入到载体中
 
【实验简介】
融合蛋白质标签是小的肽链,可以用于检测、纯化、确认目的蛋白质。为了生成标签蛋白质,需要通过基因工程将标签蛋白质的序列插入到目的蛋白质序列前,这样通过表达重组蛋白质来获得顺式标签。
标签重组蛋白质的设计通常需要依赖限制酶的传统克隆方法。这个方法需要一个供体模板来扩增所选择的标签序列和多个克隆实验步骤。而不依赖限制酶的克隆方法的出现大大地简化了这个流程,让小标签重组蛋白质的基因操作在一步反应中就可以完成,且标签序列不需要模板。
本实验例中,使用了In-Fusion HD Cloning Plus构建了包含来自两个不同模板蛋白质结构域的重组嵌合体,并从头插入了融合标签A-4 (Zhou et al. 2008; Figure 1)。
 
图1. 实验例中重组载体构建的原理图。红色字母表示引物A和引物B的5’端互补区域。A-4标签的全序列在粉色框中突出显示。
 
【用户感言】
“In-Fusion真正地帮助我按时间期限完成研究,按照说明书的要求设计引物并使用推荐的条件,我获得了接近100%的成功率。
—Fabio Antenucci, University of Copenhagen
 
【结果】
目标序列的高效率插入且未检测到脱靶效应
为了构建图1中的重组载体(图1),设计了三对PCR引物,用于生成带有重叠部分的扩增子并后续测序(图2)。挑取了3个包含插入片段的克隆,并检测图2标出的目标序列的整合、突变、基因重排的情况。测序结果证明了三个克隆均整合了目标重组开放阅读框A-A4-B,并没有突变和基因重排的情况。
 
图2. 用于确认重组载体上正确开放阅读框的测序策略。设计了三对引物,用于生成测序用的三个重叠扩增子,进一步确认结构域A和B处于A-4标签的两端的正确顺序。
 
【结论】
构建标签融合蛋白质是比较耗费时间的工作,需要按顺序进行多个亚克隆步骤来向每个载体插入目标片段。而用In-Fusion Cloning获得了100%的相对效率(3/3阳性克隆),证明了In-Fusion Cloning方法确实是一步法克隆插入小融合标签的快速有效的方法。
 
 
 
详细实验方法和步骤请见:
https://www.takarabio.com/learning-centers/cloning/in-fusion-cloning-tech-notes/de-novo-insertion-of-small-fusion-protein-tags