标准流程(Code No. R026A/B)

 
1. 按下表所示制备反应液
 
试剂 使用量 终浓度
 2×One Step High Fidelity Buffer 25 μl 1 ×
 PrimeScript II RT Enzyme Mix 1 μl  
 PrimeSTAR GXL for 1 step RT-PCR 4 μl  
 上游 Primer(20 μM)(sense) 1 μl 0.4 μM
 下游Primer(20 μM)antisense) 1 μl 0.4 μM
 Template RNA*1 *1  
 RNase Free dH2O up to 50 μl  
 
*1 使用total RNA时推荐加量10~1000 ng。
   使用Positive Control RNA时加1 μl。
 
2. 制备好的反应管置于Thermal Cycler, 选择合适的程序进行RT-PCR。
 
常用的反应条件
                45℃*2     10 min
                94℃       2 min
                       ↓
                98℃      10 sec 30 cycles
        60 or 55℃*3      15 sec
                68℃      10 sec/kb*4
 
*2 反转录反应温度
使用PrimeScript II RTase(PrimeScript II RT Enzyme Mix中含有)可以提高反应特异性,使用特异性下游引物进行反转录反应时,可在45°C进行反转录反应,不会引起RNA的降解及酶的失活。扩增超过6 kb的长链DNA时,通过将反转录反应时间延长至15分钟,可以提高cDNA的合成量。
*3 退火温度
引物的Tm值(按以下公式计算)在55℃以上时,设定为60℃
引物的Tm值(按以下公式计算)在55℃以下时,设定为55℃
※Tm值计算方法
Tm值(℃)=[(A、T数)×2]+[(G、C数)×4]-5
*4 延伸时间按照1 kb用时10 sec设定。但是,不足1 kb时设定为10 sec.