Tks Gflex™ DNA Polymerase | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
【用户实验例3】同源重组小鼠ES细胞株来源的粗提样品起始的简易克隆法 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
数据提供: | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
東京大学医科学研究所 干细胞治疗研究中心 干细胞研究分支 水野 直彬先生、山口 智之先生 |
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样品:小鼠ES细胞 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
目的序列:非公开 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
扩增片段大小:3,053 bp | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
GC含量:48% | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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小鼠ES细胞的基因组DNA与目的DNA片段通过同源重组进行导入实验。通过导入片段化载体挑选耐药性克隆至96孔板,在各孔中加入Lysis Buffer*制备粗提样品,然后使用Tks Gflex DNA Polymerase参照推荐的反应组成进行PCR。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
* 本实验客户使用自己制备的Lysis Buffer进行实验。Buffer组成虽与我公司(Lysis Buffer for PCR(Code No. 9170A))相同、但是并不是按照我公司的操作(样品添加Lysis Buffer后,再加入Proteinase K)、而是将Lysis Buffer和Proteinase K混合后添加到样品中。 注:自己制备粗提样品用的Lysis Buffer时,浓度变化会对结果产生很大的影响,请务必按照已有的组成进行制备。 |
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PCR条件: | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
94℃ | 1 min | 35 cycles | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
98℃ | 10 sec. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
60℃ | 15 sec. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
68℃ | 60 sec./kb (180sec.) |
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结果: | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
从103个同源重组ES细胞株克隆中挑选10个克隆,已确认使用Lysis Buffer和Tks Gflex从粗提样品起始能够成功进行PCR反应。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
感想: | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
对ES细胞进行同源重组或使用CRISPR/Cas9进行突变时,需要使用PCR对多个克隆同时进行筛选处理,每个克隆的细胞株需要进行多个梯度的反应以确定用于反应的最适细胞浓度,操作过程很繁琐。 Tks Gflex DNA Polymerase满足了「粗提样品进行PCR」、「模板量不同对结果无影响」、「不需要研讨PCR的循环圈数使用相同的条件得到结果」、「增加循环圈数不会增大非特异扩增」等条件,是一种不需要优化条件的PCR酶。 |
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