Takara

TB Green^® Premix Ex Taq^™ (Tli RNaseH Plus)

实验条件的选择

如果按照推荐的两步法条件进行反应，反应性能不好时，请按照下面的方法进行引物和PCR反应条件的研讨。另外，根据反应情况选择特异性不同的TB Green Premix series (Code No. RR820A/B，RR091A/B)，可提高PCR反应性能。

实验条件选择时，请从反应特异性与扩增效率两方面进行综合考虑。要求能同时满足这两个条件的反应体系，才可以在较大浓度范围内进行很好的定量。

○ 反应特异性高的实验体系应具备以下条件：

· No Template Control 时不产生引物二聚体等非特异性扩增。
· 不产生目的片段以外的扩增。

○ 扩增效率高的实验体系应具备以下条件：

· 扩增产物起峰更早（Ct值小）。
· PCR扩增效率高（接近理论值100％）。

1. Primer浓度与反应性能间的关系如下：

降低Primer浓度有助于提高特异性；提高Primer浓度有助于提高扩增效率。图示如下：

2. PCR条件与反应性能间的关系如下：

① 要提高反应特异性，可以提高退火温度。

② 要提高扩增效率，可以增加延伸时间或变为3 Step PCR反应。

③ 预变性。
预变性条件通常设定为95℃ 30 sec，使用此条件对于难变性的环状质粒DNA和基因组DNA模板基本上也能够很好的变性。如果对难变性的模板想改变变性条件，可以延长至1～2分钟。但是时间过长酶容易失活，不推荐使用2分钟以上的变性条件。

3. 各种试剂与反应性能间的关系如下：

Takara Bio公司有三种TB Green嵌合法Real Time PCR试剂，这些试剂的反应特异性以及扩增效率间有以下关系。TB Green Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus) (Code No.RR420A/B)是扩增效率高的试剂，但是，如果想提高反应特异性，使用TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (Code No. RR820A/B) 或TB Green Premix DimerEraser (Code No.RR091A/B) 则更有效。