PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) | |||||||||||||||||||||||||||
反转录反应:探针法 qPCR分析法 | |||||||||||||||||||||||||||
1. 去除基因组DNA反应 | |||||||||||||||||||||||||||
按如下成分于冰上配制反应混合液,为了保证反应液配制的准确性,进行各项反应时,应先按反应数+2的量配制Master Mix,然后再分装到每个反应管中,最后加入RNA样品。 | |||||||||||||||||||||||||||
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42℃ 2 min(或者室温5 min*2) | |||||||||||||||||||||||||||
4℃ | |||||||||||||||||||||||||||
2. 反转录反应 | |||||||||||||||||||||||||||
反应液配制请在冰上进行。为了保证反应液配制的准确性,进行各项反应时,应先按反应数+2的量配制Master Mix,然后再分装10 μl到每个反应管中*3。轻柔混匀后立即进行反转录反应。 | |||||||||||||||||||||||||||
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37℃ 15 min*6 | |||||||||||||||||||||||||||
85℃ 5 sec | |||||||||||||||||||||||||||
4℃*7 | |||||||||||||||||||||||||||
*1: 20 μl反转录反应体系中,TB Green qPCR法最多可使用1 μg的Total RNA,探针qPCR分析法最多可使用2 μg的Total RNA。 *2: 室温反应时,可以延长至30分钟。 *3: 若不配制Master Mix,向步骤1的反应液中添加试剂时,要先加入RNase Free ddH2O和5×PrimeScript Buffer 2 (for Real Time)混合均匀,以使gDNA Eraser的活性充分受到抑制, 再添加RT Primer Mix、PrimeScript RT Enzyme Mix I,轻轻混匀进行反转录反应。 *4: 使用RT Primer Mix可以高效合成cDNA。因为实验目的不同,也可以不使用RT Primer Mix,而选择Oligo dT Primer或Gene Specific Primer进行反转录反应,引物使用量如下: Oligo dT Primer 50 pmol/20 μl反应体系 Gene Specific Primer 5 pmol/20 μl反应体系 *5: 反转录体系可以根据需要相应扩大。 *6: 使用Gene Specific Primer时,建议反转录反应条件设置为42℃ 15 min。PCR反应有非特异性扩增时,将温度升到50℃会有所改善。 *7: 合成的cDNA需要长期保存时,请于-20℃或更低温度保存。 |
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注意: | |||||||||||||||||||||||||||
1) 在反转录反应中,TB Green qPCR法的RT Primer Mix 用量为1 μl,探针qPCR分析法的用量为4 μl。 | |||||||||||||||||||||||||||
2) 得到的RT反应液加入到下一步的Real Time PCR反应体系中,其加入量不要超过Real Time PCR反应体积的1/10(V/V)量。 | |||||||||||||||||||||||||||