Takara

Premix Ex Taq^™ (Probe qPCR)

应用LightCycler/LightCycler 480 System的操作方法

请按照LightCycler/LightCycler 480（Roche Diagnostics公司）的使用说明书要求进行实验操作

1. 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

试剂	使用量	终浓度
Premix Ex Taq（Probe qPCR）（2X）	10.0 μl	1X
PCR Forward Primer（10 μM）	0.4 μl	0.2 μM^*1
PCR Reverse Primer（10 μM）	0.4 μl	0.2 μM^*1
Probe	0.8 μl	^*2
DNA模板	2.0 μl	^*3
dH2O（灭菌水）	6.4 μl
Total	20.0 μl

*1 通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.1-1.0 μM范围内调整引物浓度。
*2 使用的探针浓度，与使用的Real Time PCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行。
*3 模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷贝数不同而不同，进行梯度稀释研讨适当的模板添加量。模板DNA添加量最好在100 ng以下。以RT-PCR反应的cDNA (RT反应液) 为模板时，添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。

2. 进行Real Time PCR反应。

PCR反应用毛细管请用离心机轻轻离心后放入LightCycler中进行Real Time PCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。有关PCR的具体反应条件请参照「PCR反应条件概述」。

＜LightCycler＞

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

95℃ 30秒 20℃/秒

1 Cycle

Stage 2：PCR反应

95℃ 5秒 20℃/秒

60℃ 20秒 20℃/秒

40 Cycles

＜LightCycler 480 System＞

两步法PCR扩增标准程序：

Denature

95℃ 30秒 (Ramp rate: 4.4℃/sec)

1 Cycle

PCR

Analysis Mode: Quantification

95℃ 5秒 (Ramp rate: 4.4℃/sec)

60℃ 30秒 (Ramp rate: 2.2℃/sec, Acquisition Mode : Single)

Cooling Cycle

Cooling

50℃ 30秒 (Ramp rate: 2.2℃/sec)

1 Cycle

◆特别提示：
本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5-15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量准确度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。

3. 实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。分析方法参见仪器的操作手册。